[发明专利]等位基因编辑及其应用

说明书

本发明涉及在真核细胞内测定同源定向修复(HDR)事件的方法，其中所述细胞表达表面蛋白的第一同种型，其与所述表面蛋白的第二同种型在氨基酸标志物方面不同。该方法包括以下步骤：诱导DNA双链断裂；提供HDR模板DNA修复构建体，其包含与表面蛋白的第二同种型对应的氨基酸标志物，和随后测定所述细胞上所述表面蛋白的所述第一或第二同种型的表达，其中所述第二同种型的表达表明成功的HDR事件。本发明还涉及在真核细胞内编辑目标基因组位置的方法，和在未编辑和编辑细胞的组合物中选择性耗尽或富集编辑细胞的方法。

技术领域

本发明涉及在基因编辑，特别是CRISPR/Cas基因编辑期间监测和优化DNA双链断裂的同源定向修复效率的方法。本发明进一步涉及基于多重HDR富集已经历HDR的细胞的细胞制剂的方法，以及用于体外或体内选择性耗尽编辑细胞的方法。

背景技术

基于CRISPR的基因工程是在细胞中引入基因组突变的灵活方式。通过使用与核酸酶复合的“可编程的”用户定义的短向导RNA，可以在所需的基因组位点处诱导双链DNA(dsDNA)断裂。经常使用的核酸酶包括Cas蛋白，特别是Cas9，但可以是其变体。变体包括具有改变的DNA结合特异性的改变的核酸酶，或添加了不同特征(例如转录激活或抑制或酶活性)以直接编辑核苷酸的融合蛋白。还可以修饰Cas核酸酶以诱导基因组DNA的单链“切口”。细胞对这些诱导的DNA断裂的应答是DNA修复机制的激活，其主要由非同源末端连接(NHEJ)途径和同源定向修复(HDR)途径组成。NHEJ通常导致随机插入和缺失(indel)，其可用于删除基因。这可用于实验目的，但是对于临床使用，固有的随机NHEJ修复途径具有显著的风险。靶向的精确基因编辑更安全，因此更令人满意。HDR途径通过基于DNA模板修复(ds)DNA断裂提供了引入精确突变的机会。然而，利用HDR途径进行生物技术目的的效率远低于利用NHEJ。NHEJ和HDR发生的比例为约9:1。克服低HDR效率的瓶颈是缺乏简单的系统来定量单个细胞中的NHEJ和HDR事件。用于评估基因编辑事件的许多测定是半定量的。对整个细胞群的测序不提供关于每个细胞的事件频率的信息，并且不允许区分纯合性与杂合性。尽管可以克隆细胞系以获得单个细胞信息，但是这种方法是繁琐的并且在原代细胞中是不可能的。替代性地，已经开发了基于流式细胞术的报告系统以定量基于单个细胞的基因编辑。然而，这样的系统依赖于对评估的细胞或生物体的遗传操作(大多数在其使用之前)，因此限制了它们的使用。

本发明所要解决的问题是提供一种简单的成本经济的系统，该系统允许快速的基于单个细胞的定量基因编辑事件，而不需要转基因，也不需要事先操作细胞。本发明的另一个问题是提供一种系统，其用于永久地标记和追踪细胞，并允许在体外或体内选择性地耗尽标记或未标记的细胞。这些问题由独立权利要求的主题解决。

发明内容

根据本发明的第一个方面，提供了测定第一同源定向修复(HDR)事件的方法。HDR事件发生在真核细胞的第一基因组位置。细胞表达第一表面蛋白的第一同种型(等位基因)，其与所述第一表面蛋白的第二同种型(等位基因)在氨基酸标志物方面不同，其中所述第一同种型包含由核酸序列A编码的氨基酸标志物A，所述第二同种型包含由核酸序列B编码的氨基酸标志物B。第一基因组位置包含核酸序列A。方法包括以下步骤：

a.在所述第一基因组位置诱导第一DNA双链断裂；

b.提供第一DNA修复构建体，其包含所述核酸序列B和第一对同源臂(与所述第一基因组位置的5’和3’DNA序列同源)，特别是用所述第一DNA修复构建体转染所述细胞；

c.测定所述细胞上所述第一表面蛋白的第一和/或第二同种型的表达，并任选地，基于所述表面蛋白的第一和/或第二同种型的表达纯化所述细胞；和

d.测定所述第一HDR事件的发生，其中所述细胞上的所述第一表面蛋白的所述第二同种型的表达等于所述第一HDR事件的发生。