[发明专利]类器官培养用细胞培养基、培养方法及类器官

说明书

类器官培养用细胞培养基包含选自胰岛素样生长因子1(Insulin‑like growth factor 1，IGF1)、成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2，FGF2)、及表皮调节素(Epiregulin，EREG)的至少2种以及选自下述i)～iii)的成分中的至少1种：i)Wnt激动剂、ii)骨形态发生蛋白(bone morphogeneitc protein，BMP)抑制剂、iii)转化生长因子‑β(transforming growth factor‑β，TGF‑β)抑制剂。

技术领域

本发明涉及类器官培养用细胞培养基、培养方法及类器官。

本申请提出基于2016年5月18日向日本提出申请的日本专利特愿2016-099995的优先权请求，将其内容引用于本申请。

背景技术

肠道是人体中与外界接触的面积最大的脏器，具有消化吸收等维持生命必不可少的功能。肠道功能的大部分由覆盖其内层的肠道上皮负责。肠道上皮由绒毛和隐窝这2个区域构成，所述绒毛由3系的分化细胞(粘液细胞、吸收上皮细胞、内分泌细胞)形成，所述隐窝主要由未分化增殖细胞形成。在小肠肠腺，肠腺底部存在产生抗菌肽的潘氏(Paneth)细胞。最近，通过分子遗传学的细胞谱系分析，发现夹于潘氏细胞之间的Lgr5阳性细胞(也称为“CBC(隐窝基底柱状，Crypt base columnar)细胞”)为肠道上皮干细胞。Lgr5阳性肠道上皮干细胞产生被称为短暂扩增细胞(Transit amplifying cell)的前体细胞，这些前体细胞无永久的自我复制能力，而且分化能力也仅限于1～3系细胞。短暂扩增细胞在隐窝内随着2～4次的分裂而不断分化，在绒毛完成最终分化。这些分化细胞在绒毛的顶点剥离，通过细胞凋亡而死亡。肠道上皮是新陈代谢快的组织，从隐窝的干细胞用4～5天就移动至绒毛的顶点。潘氏细胞与其他分化细胞不同，在分化的同时向隐窝底部移动，具有长达2个月的细胞寿命。

肠道上皮干细胞的自我复制机理根据数项基因改造小鼠的结果已知受到Wnt信号和骨形态发生蛋白(Bone Morphogeneitc Protein，BMP)信号的控制。作为Wnt信号的抑制分子的APC(腺瘤性结肠息肉病，Adenomatous polyposis coli)的肠道上皮特异性敲除小鼠中，显示肠道上皮细胞的过度增殖和腺瘤形成。此外，使作为BMP的抑制蛋白的头蛋白(Noggin)在肠道上皮细胞过度表达的小鼠中，观察到异位隐窝形成，提示BMP信号对肠道上皮干细胞起到抑制性作用。实际上，确认Wnt信号有在隐窝底部活性高，向管腔侧降低的梯度。另一方面，已知BMP信号显示与Wnt信号相反的梯度。

此外，长久以来都无法实现肠道上皮细胞的长期培养。这被认为是由于维持肠道上皮干细胞所需的增殖因子不明。近年来，通过将肠道上皮干细胞粘接于细胞外基质上，在添加BMP抑制剂、促分裂增殖因子和Wnt激动剂且包含动物或细胞用基本培养基的细胞培养基的存在下进行培养，成功实现了肠道上皮干细胞的长期维持(参照例如专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

日本专利特许第5458112号公报

发明内容

发明所要解决的技术问题

专利文献1中记载的培养方法中所用的细胞培养基中，存在表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)的表达因表皮生长因子(Epidermal GrowthFactor，EGF)的刺激而下降的问题。对于该问题，通过添加p38抑制剂，可维持EGFR的表达。然而，包含p38抑制剂的培养基、培养方法中，可能会引发分化抑制或细胞死亡，部分的人的组织、肿瘤组织的培养无法实现。

为了解决上述课题，本发明提供可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织的类器官培养用细胞培养基。