[发明专利]活化的梭菌神经毒素的生产

说明书

本发明涉及一种生产基本上不含未活化产物的活化梭菌神经毒素的方法，包含这种活化梭菌神经毒素的组合物及其在治疗中的用途。

技术领域

本发明涉及一种生产基本上不含未活化产物的活化的梭菌神经毒素的方法，包含这种梭菌神经毒素的组合物及其在治疗中的用途。

背景

梭状芽孢杆菌(Clostridia)属细菌产生高度有效且特异性的蛋白质毒素，其可以毒害神经元和它们被递送到的其他细胞。此类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的神经毒素。

梭菌神经毒素中已知有一些最有效的毒素。举例来说，取决于血清型，肉毒杆菌(botulinum)神经毒素对于小鼠的半数致死剂量(LD₅₀)值为0.5至5ng/kg。破伤风和肉毒杆菌毒素都通过抑制受影响的神经元的功能，特别是神经递质的释放起作用。虽然肉毒杆菌毒素作用于神经肌肉接点并抑制外周神经系统中的胆碱能传递，但破伤风毒素在中枢神经系统中起作用。

在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其被蛋白水解切割事件翻译后修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，该位点通常称为位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间的激活位点。正是这种双链形式是神经毒素的最具活性形式。这两条链被称为重链(H链)，其具有约100kDa的分子量，和轻链(L链)，其具有约50kDa的分子量。H链包含N-端易位组分(H_N结构域)和C-端靶向组分(H_C结构域)。切割位点位于L-链和易位结构域组分之间。在H_C结构域与其靶神经元结合并通过内体将结合的毒素内化入细胞后，H_N结构域将L链易位穿过内体膜并进入胞质溶胶，并且L-链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。

非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白(例如SNAP-25、VAMP或Syntaxin)来起作用-参见Gerald K(2002)“Cell and MolecularBiology”(第4版)John Wiley&Sons，Inc。首字母缩写词SNARE来源于术语Soluble NSFAttachment Receptor，其中NSF是指N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白与细胞内囊泡融合所必需的，因此是通过囊泡转运从细胞中分泌分子所必需的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且对SNARE蛋白表现出高底物特异性。因此，一旦递送至期望的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。

鉴于SNARE蛋白质的普遍性质，梭菌神经毒素如肉毒杆菌毒素已成功用于各种疗法中。