[发明专利]在木霉属中生产发酵产物的方法

说明书

本申请公开了使用蔗糖作为碳源使包含异源转化酶基因的重组里氏木霉发酵的方法。

序列表的引用

本申请含有计算机可读取形式的序列表，将其通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及在包含蔗糖的发酵培养基中在里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞中生产发酵产物的方法。发酵产物可以是蛋白质产物，例如酶产物。

背景技术

里氏木霉是一种众所周知的丝状真菌，其近年来经常用于发酵过程，例如用于生产蛋白质产物的发酵过程，特别是用于生产酶的发酵过程。

已知里氏木霉产生许多种纤维素酶和半纤维素酶，并且这种生物经常用于生产包括纤维素酶和/或半纤维素酶的酶产物。然而，里氏木霉的用途不限于生产纤维素酶和半纤维素酶，还包括生产其他酶产物。

蔗糖典型地用作许多微生物发酵过程的碳源，这些发酵过程包括细菌(例如芽孢杆菌属(Bacillus)物种)和丝状真菌(例如曲霉属(Aspergillus)物种)中的蛋白质生产。然而，里氏木霉菌株不能有效地利用蔗糖作为碳源。

蔗糖具有有益的高水溶性，这意味着它可以有利地用作分批补料发酵中的高浓缩的进料，因为该碳源以适当的量递送而不会使发酵液稀释太多。

另外，糖蜜(一种糖产生的副产物)含有大量的蔗糖并且因此可以用作发酵过程的相对便宜的碳源，特别是在接近于炼糖厂的地方。

Dernt等人,2013,Biotechnology for Biofuels[用于生物燃料的生物技术]6:62公开了木聚糖酶调节因子1(xyr1)的突变，该突变导致在里氏木霉中的葡萄糖盲(glucoseblind)水解酶表达表型，即该菌株不能感测到影响基因表达的葡萄糖的存在。该突变被鉴定为在xyr1的位置824处的丙氨酸被缬氨酸取代。

希望使用蔗糖作为里氏木霉发酵的碳源以从这种方便的营养素中受益。

发明内容

本发明提供了一种生产发酵产物的方法，该方法包括使重组里氏木霉细胞在包含蔗糖的培养基中发酵。

定义

异源多肽：术语“异源多肽”意指不是由里氏木霉天然产生的多肽。异源多肽可以衍生自不同的生物体或者它可以是变体，即包含取代、插入或缺失的与天然存在的多肽不同的多肽。术语“异源多肽”包括融合蛋白、嵌合蛋白和变体。

转化酶：术语“转化酶”意指具有转化酶活性的多肽。转化酶(EC 3.2.1.26)催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖。转化酶的系统名称是β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶，但该酶也称作其他名称，例如β-呋喃果糖苷酶、蔗糖酶(saccharase)、蔗糖酶(sucrase)和β-果糖苷酶。根据糖苷水解酶分类，在糖苷水解酶家族32(GH-32)中发现转化酶(Henrissat,1991,Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316和cazy.org)。转化酶基因的实例是编码来自黑曲霉(Aspergillus niger)的胞外转化酶的基因，该基因具有SEQ ID NO:1的成熟蛋白的氨基酸序列。在一些实施例中，SEQ ID NO:1的成熟蛋白质是SEQ ID NO:1的氨基酸54至589。

天然多肽：术语“天然多肽”意指由里氏木霉天然产生的多肽。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下配置：控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，这样使得所述控制序列引导所述编码序列的表达。