[发明专利]辣根过氧化物酶-IGG融合蛋白的制备

说明书

本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包含通过肽接头与辣根过氧化物酶或与碱性磷酸酶连接的scFv。融合蛋白还包括组氨酸标签和任选地内质网滞留信号。本发明还包括编码融合蛋白的核酸、含有核酸的表达载体、用表达载体转化的植物细胞和制备本发明融合蛋白的方法。

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包含通过肽接头与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶连接的scFv。融合蛋白还包括组氨酸标签和任选地内质网滞留信号。本发明还包括编码融合蛋白的核酸、含有核酸的表达载体、用表达载体转化的植物细胞和制备本发明融合蛋白的方法。

背景技术

辣根(Armoracia rusticana，syn.Cochlearia armoracia)是十字花科(Brassicaceae)(其还包括芥菜、芥末、西兰花和卷心菜)的多年生植物。它是一种用作香料的根茎类蔬菜。

辣根过氧化物酶(HRP)是从辣根(Armoracia rusticana)的根中分离得到的一种酶，属于过氧化物酶的亚铁原卟啉基团。HRP蛋白是含有四个二硫键的单链多肽。

HRP酶广泛用于生物化学应用，主要是因为其能够放大弱信号并提高靶分子的可检测性。它是具有多种亚型的金属酶，其中研究最多的亚型是C型。

HRP是具有6个赖氨酸残基的44,173.9道尔顿糖蛋白，所述6个赖氨酸残基可以与分子缀合。当与适当的底物一起孵育时，它会产生缀合分子的有色、荧光或发光衍生物，使其能够被检测和定量。

碱性磷酸酶(AP)是86千道尔顿的同源二聚体蛋白酶，含有两个对其催化功能至关重要的锌原子。每个单体包括一个锌原子。AP在碱性pH下具有活性。

AP存在于许多生物中，包括原核生物和真核生物。各种形式具有相同的一般功能，但可以具有适合于它们起作用的环境的不同结构形式。

使用底物使HRP或AP酶或其缀合物的存在变得可见，所述底物在使用过氧化氢作为氧化剂通过HRP或AP氧化时产生一种可通过分光光度法检测到的特征变化。

HRP由于其单体性质和易于产生有色产物，也常用于例如ELISA和免疫组织化学等技术。传统上，商业上可获得的HRP或AP连接的二级抗体通常是由HRP或AP与抗体的化学结合制成的。这可能导致产品的非均质组成，以及HRP或AP和抗体的活性降低，并且化学计量通常不是理想的标记蛋白与抗体1:1的比例——所有这些都影响ELISA和蛋白质印迹(western blot)特异性和敏感性。通过基因融合和重组产生的标记抗体产物的表达，这些问题得以缓解。一种可能的解决方案是在大肠杆菌中产生融合蛋白，然而，这样做的问题在于产物是不可溶的——大肠杆菌中缺乏翻译后糖基化导致表达的重组蛋白在包涵体中聚集，从而阻碍了HRP的活动。已经进行了一些研究以在毕赤酵母(Pichia pastoris)中产生重组基因融合的HRP抗体(抗阿特拉津(atrazine)的抗体的Fab片段(Koliasnikov等人，2011年))以缓解溶解度问题。

本发明导致重组融合产物的产生，所述重组融合产物由与单链可变片段(scFv)融合的标记蛋白(HRP或AP)组成，所述单链可变片段是比上述Fab片段更小的抗体区域。此外，本发明依赖于在植物中产生的融合蛋白。

发明内容

本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白由通过肽接头与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶连接的scFv组成。融合蛋白还包括组氨酸标签和任选地内质网滞留信号。

根据本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，其包含编码辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的多肽；肽接头；编码scFv的多肽；任选地内质网滞留信号和组氨酸标签。

本发明的第二方面提供了包含选自式I或式II的式子的融合蛋白：