[发明专利]E-选择素配体的糖工程化

说明书

本发明提供了增强E‑选择素和/或L‑选择素配体在细胞表面上的表达的方法。还提供了使得细胞能够与E‑选择素和/或L‑选择素结合和/或增加细胞与E‑选择素和/或L‑选择素的结合的方法，增加移植的细胞群的归巢和/或外渗的方法，产生用于移植入受试者的经修饰的细胞包括干细胞的方法，治疗或改善受试者的症状、疾病或损伤的作用的方法，以及诱导和/或增强受试者的细胞群归巢至治疗靶标的方法。本发明进一步提供了用于治疗或改善受试者的症状、疾病或损伤的作用的包含通过本发明的方法产生的细胞群的药物组合物和包含这样的组合物的试剂盒。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年5月20日提交的美国临时专利申请号62/339,704和2016年6月24日提交的美国临时专利申请号62/354,350的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文，如同在本文中完整叙述。

发明背景

间充质干细胞(MSC)由于其在体外方便的分离和扩增、多谱系分化能力、组织修复营养作用和有效的免疫调节能力而对细胞治疗具有很大前景(Dominici 2006，Griffin2013)。特别地，因为MSC是骨形成成骨细胞的前体，所以对于治疗全身性骨病如骨质疏松症或成骨不全症而言，这些细胞已引起人们的极大兴趣。然而，为了实现该目标，首先必须优化血管内施用的MSC的向骨性。

循环细胞向骨的募集取决于E-选择素受体/配体粘附相互作用。E-选择素是钙依赖性凝集素，其在骨髓微血管上组成型表达，并在炎性部位的微血管上诱导表达(Sipkins2005，Schweitzer 1996，Sackstein 2009)。E-选择素原型结合唾液酸化的末端四糖基序，称为唾液酸化Lewis X(sLe^X；NeuAc-α(2,3)-Gal-β(1,4)-[Fuc-α(1,3)]GlcNAc-R)。sLe^X能够展示在修饰特定的细胞表面糖蛋白例如PSGL-1、CD43或CD44的聚糖链的末端。当这些蛋白质展示sLe^X时，它们能够分别用作E-选择素配体CLA、CD43E或HCELL(Dimitroff 2001，Sackstein 2008)。这些结构在造血干细胞和祖细胞(HSPC)和其他造血细胞上以高水平表达，但在MSC上完全不存在。部分由于E-选择素配体的这种缺乏，在静脉内移植时只有一小部分注射的MSC归巢于骨(Schrepfer 2007，Lee 2009，Ankrum 2010)。

产生E-选择素配体所必需的聚糖修饰在高尔基体中通过以逐步方式起作用的特定糖基转移酶进行。人MSC表达高水平的CD44，以及合成sLe^X所需的糖基转移酶，其中值得注意的例外是任何介导α-(1,3)-岩藻糖基化的岩藻糖基转移酶：FTIII、FTIV、FTV、FTVI或FTVII的表达的完全缺乏(Sackstein 2009)。因此，MSC在用末端唾液酸化的乳糖胺(NeuAc-α(2,3)-Gal-β(1,4)-GlcNAc-R)修饰的细胞表面上表达CD44，仅需要添加待被转化为有效的E-选择素配体HCELL的α-(1,3)-岩藻糖。以前，我们开发了一种通过将完整细胞与纯化的α-(1,3)-岩藻糖基转移酶FTVI及其核苷酸糖供体GDP-岩藻糖一起孵育来修饰MSC表面上的聚糖以产生E-选择素配体的方法。被称为“糖基转移酶介导的立体取代”(GPS)的该方法导致在MSC细胞表面上临时产生E-选择素配体(主要是HCELL)。已经证明这种FTVI驱动的MSC的外岩藻糖基化稳健地增强内皮细胞上E-选择素介导的束缚(tethering)和滚动，并且在临床前研究中，已经产生MSC向骨性(即归巢到骨)(Sackstein 2008)。部分基于这些结果，该方法的功效现在正在使用经外岩藻糖基化的MSC治疗骨质疏松症的临床试验中进行研究(NCT02566655，clinicaltrials.gov)。

发明概述