[发明专利]具有改善的凝乳特性的凝乳酶的变体

说明书

具有改善的凝乳特性的凝乳酶变体。

技术领域

本发明涉及具有改善的凝乳特性的凝乳酶的变体。

背景技术

凝乳酶(EC 3.4.23.4)和胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)是哺乳动物胃的乳凝固酶，它们是属于肽酶大类的天冬氨酸蛋白酶。

当在胃粘膜细胞中产生时，凝乳酶和胃蛋白酶分别作为酶促失活的前凝乳酶原(pre-prochymosin)和前胃蛋白酶原(pre-pepsinogen)出现。当分泌凝乳酶时，N末端肽片段、即前片段(pre-fragment)(信号肽)被切除，得到包括原片段(pro-fragment)的凝乳酶原(prochymosin)。凝乳酶原是一种基本上无活性的酶形式，然而，其通过自催化去除原片段而在酸性条件下被活化成活性的凝乳酶。这种活化在适当的pH条件下在体内在胃腔中发生或在酸性条件下在体外发生。

已经广泛研究了牛(bovine)(即黄牛(Bos taurus))的前凝乳酶原、凝乳酶原和凝乳酶的结构和功能特征。牛前凝乳酶原分子的前部分(pre-part)包含16个氨基酸残基，相应的凝乳酶原的原部分(pro-part)具有42个氨基酸残基的长度。活性牛凝乳酶包含323个氨基酸。

凝乳酶在例如牛、骆驼、山羊、水牛、绵羊、猪、人、猴和大鼠的哺乳动物物种中天然产生。

多年来，牛和骆驼凝乳酶已经在乳品工业中是商业可得的。

通过乳凝固酶(例如凝乳酶和胃蛋白酶)对乳进行酶促凝固是奶酪制造中最重要的过程之一。酶促凝乳是一个两阶段过程：第一阶段，其中蛋白水解酶凝乳酶或胃蛋白酶攻击κ-酪蛋白，导致酪蛋白胶束结构的亚稳态，和第二阶段，其中乳随后凝固并形成凝块(参考文献1)。

WO02/36752A2(科.汉森(Chr.Hansen))描述了骆驼凝乳酶的重组生产。

WO2013/174840A1(科.汉森)描述了牛和骆驼凝乳酶的突变体/变体。

WO2013/164479A2(DSM)描述了牛凝乳酶的突变体。

下面即将列出的参考文献可能在本文中被视为描述凝乳酶突变体的参考文献：

-Suzuki等人：定点诱变揭示了Thr218、Lys220和Asp304在凝乳酶中的功能贡献(Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218,Lys220and Asp304 in chymosin),Protein Engineering,第4卷,1990年1月,第69-71页；

-Suzuki等人：通过定点诱变改变凝乳酶的催化性质(Alteration of catalyticproperties of chymosin by site-directed mutagenesis),Protein Engineering,第2卷,1989年5月,第563-569页；

-van den Brink等人：通过糖基化增加凝乳酶的产生(Increased production ofchymosin by glycosylation),Journal of biotechnology,第125卷,2006年9月,第304-310页；

-Pitts等人：在里氏木霉中产生的凝乳酶pH最佳突变体的表达和表征(Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced inTricoderma reesei),Journal of biotec

hnology,第28卷,1993年3月,第69-83页；