[发明专利]生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产生的重组腺相关病毒(rAAV)载体

权利要求书

1.一种以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)收获包含rAAV载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液；

(b)任选地通过切向流过滤任选地浓缩在步骤(a)中收获的所述细胞和/或所述细胞培养物上清液，以产生浓缩的收获物；

(c)任选地通过微流化裂解在步骤(a)中产生的所述收获物或在步骤(b)中产生的所述浓缩收获物以产生裂解物；

(d)过滤步骤(c)中产生的所述裂解物以产生澄清的裂解物；

(e)将步骤(d)中产生的所述澄清的裂解物进行离子交换柱层析，以产生包含纯化的rAAV载体颗粒的柱洗脱液，并任选通过切向流过滤浓缩所述柱洗脱液，以产生浓缩的柱洗脱液；

(f)将在步骤(e)中产生的所述柱洗脱液或所述浓缩的柱洗脱液与氯化铯混合以产生混合物，并使所述混合物进行梯度超速离心以基本上从空衣壳AAV颗粒和其他AAV载体相关杂质分离出真正的rAAV载体颗粒；

(g)(1)收集在步骤(f)中分离的所述真正的rAAV载体颗粒，以及(g)(2)在具有非离子表面活性剂的缓冲液中配制所收集的所述真正的rAAV载体颗粒；

(h)将步骤(g)(2)中的所述真正的rAAV载体颗粒通过切向流过滤进行缓冲液交换以产生AAV载体制剂；以及

(i)过滤步骤(h)中产生的所述AAV载体制剂，从而以高回收率或高滴度产生真正的rAAV载体颗粒制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(1)的所述缓冲剂包含氯化钠和/或磷酸钠。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(1)的所述缓冲液包含浓度为约10mM至浓度为约500mM的氯化钠。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(1)的所述缓冲液包含浓度为约5mM至浓度为约50mM的磷酸钠。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括聚亚烷基二醇。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含至少一个聚乙二醇嵌段和至少一个聚丙二醇嵌段。

7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)(2)的所述非离子表面活性剂包括烷基多糖苷，十六十八醇，十六醇，椰油酰胺DEA，椰油酰胺MEA，癸基葡糖苷，乙氧基化物，IGEPALCA-630，Isoceteth-20，葡萄糖苷，麦芽糖苷，甘油一月桂酸酯，乙基苯基聚乙二醇(nonidetP-40)，壬基酚聚醚(nonoxynols)，如壬基酚聚醚-9，NP-40，八乙二醇单十二烷基醚，N-辛基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷，辛基葡糖苷，油醇，PEG-10向日葵甘油酯，五乙二醇单十二烷基醚，泊洛沙姆，如泊洛沙姆407，泊洛沙姆188(聚(环氧乙烷-共-聚环氧丙烷))，聚甘油聚蓖麻油酸酯，脱水山梨糖醇，硬脂醇，Triton X-100和吐温80。

8.根据权利要求7的方法，其中所述乙氧基化物包括乙氧基化脂肪酸、醇乙氧基化物、三苯乙烯基苯酚乙氧基化物或乙氧基化脱水山梨糖醇脂肪酸酯。

9.根据权利要求7的方法，其中所述脱水山梨糖醇包括脱水山梨糖醇单硬脂酸酯或脱水山梨糖醇三硬脂酸酯。