[发明专利]生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产生的重组腺相关病毒(rAAV)载体

说明书

提供了以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法。还提供了将rAAV载体浓缩至高浓度的方法，例如，高达5E+13(5×10¹³)个载体基因组/毫升(Vg/ml)，几乎没有任何rAAV聚集体。

相关申请

本申请要求于2016年7月21日提交的美国临时专利申请No.62/365,312的优先权。前述申请的包括所有文本、表格、序列表和附图在内的全部内容通过引用并入本文。

引言

切向流过滤(TFF)是生物技术工业中使用的技术，其通过超滤过程(UF)浓缩产物并通过渗滤(DF)进行缓冲液交换以配制产物。然而，当TFF用于进行重组腺相关病毒(rAAV)载体的UF/DF时，在该过程中丢失了大量的rAAV载体。当rAAV载体高度浓缩时，甚至会丢失更多的载体。在UF/DF过程中损失的载体量使得几乎不可能制备高浓度的rAAV载体制备物，这在rAAV相关基因治疗产物的开发中是非常需要的。

在rAAV载体的制造中经常观察到的另一种现象是rAAV载体倾向于在UF/DF过程中聚集，特别是当载体制备物高度浓缩时，例如1E+13vg/ml(1×10¹³载体基因组/ml；vg：载体基因组)或更高。rAAV载体聚集似乎依赖于滴度，滴度越高，则载体聚集越多。载体聚集还导致制造期间的载体损失。此外，当在临床中使用时，聚集的载体是患者安全性的关注点。

在使用上述TFF技术的UF/DF过程中，rAAV载体聚集和载体丢失的问题代表了rAAV载体的制备和/或纯化中的重要过程挑战。本发明解决了这些问题。

发明内容

在许多不同的假设中，在使用TFF技术的UF/DF过程中的rAAV载体聚集和载体丢失可以是过程依赖性的和/或制剂依赖性的。基于这样的假设，设计了新的制剂并为UF/DF过程创建了新的操作参数，以改善载体回收率并减少、最小化或防止rAAV载体聚集。在用于UF/DF过程的发明配方和操作参数中，rAAV载体恢复得到改善并且rAAV载体聚集减少。本文公开的数据显示，单独或组合地为UF/DF过程创建的新制剂和操作参数使得从初始rAAV载体制备中回收的总体rAAV载体的显著增加。事实上，rAAV载体可以浓缩至5E+13vg/ml(5×10¹³载体基因组/ml)而没有显著的载体损失，并且载体主要是单体，从而表明聚集减少。

本文公开的发明制剂和/或操作参数将使rAAV载体能够浓缩至高浓度，例如高达5E+13(5×10¹³)载体基因组/毫升(Vg/ml)，几乎没有任何rAAV聚集体。此外，本文公开的发明制剂和/或操作参数将改善来自缓冲液交换的rAAV载体回收或使用切向流过滤技术(TFF)浓缩载体。当需要高浓度的rAAV制备物时，本文公开的发明制剂和/或操作参数可以支持使用rAAV载体的任何基因疗法临床应用，例如用于溶酶体贮积病(例如神经元蜡样脂褐质沉积症2(CLN2))的rAAV介导的基因疗法，用于血液凝固缺陷(血友病A和血友病B)的rAAV介导的基因疗法等。通过使用TFF的超滤(UF)和渗滤(DF)过程的改进的载体回收也将降低rAAV载体制造的商品的成本，并且还提供更稳健和一致的rAAV载体或临床应用。

因此，本发明为rAAV制造过程提供了各种益处。在一实施方案中，rAAV载体回收增强，并且可以显著增强，从而从开始到结束提供改善的产量(例如，从开始到结束提供70％或更高的rAAV载体产量)。在另一实施方案中，减少、最小化或预防rAAV聚集，特别是当rAAV载体浓缩至高rAAV载体滴度时。在进一步的实施方案中，rAAV载体以高浓度(例如，至少以1E+12，5E+12，1E+13或5E+13vg/ml)产生，这适用于需要rAAV载体的高滴度和/或小给药量(例如注射或输注)的临床应用。在另外的实施方案中，本发明提供以下单独的或彼此任意组合实施方案、或与本文公开的其他实施方案的任何组合中的一种或多种：

(1)用于制造rAAV载体的高度可靠/一致的UF/DF过程，其可根据操作变化降低制造风险；