[发明专利]含有Fc的蛋白的纯化方法

说明书

本发明涉及纯化含有Fc区的蛋白，例如抗体和Fc融合蛋白的方法。特别地，本发明涉及一种导致聚集体蛋白水平降低的纯化方法，所述方法包括将含有Fc区的蛋白吸附到温度响应性蛋白A树脂上，以及用洗脱缓冲液在低于约35C的温度从所述树脂中洗脱所述蛋白，所述洗脱缓冲液包含离液剂、糖醇、和至少一种氨基酸。还描述了使用洗脱缓冲液将完全组装的抗体与其半抗体形式分离的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年7月22日提交的美国临时申请号62/365,943的权益，将其通过引用以其全部内容并入本文。

电子提交的文本文件的说明

本申请含有一份已经以ASCII格式电子提交的序列表并且将该序列表通过引用以其全部内容并入本文。2017年7月20日创建的序列表的计算机可读格式副本命名为A-2036-WO-PCT_SeqList_ST25，并且大小为8.81千字节。

技术领域

本发明涉及生物药剂制造领域。特别地，本发明涉及在纯化操作过程中减少或防止含有Fc区的蛋白聚集的方法。本发明还涉及从难以去除的污染物(例如半抗体)中分离抗体的方法。

背景技术

聚集体仍然是基因工程化的生物制剂(特别是包含免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，例如多特异性抗原结合蛋白)生产中的主要问题。蛋白聚集体由于其强烈的免疫原性而在治疗药物中是不可接受的(Maggio,Journal of Excipients and Food Chemicals[辅料与食品化学杂志],第3卷(2):45-53,2012；Sauerborn等人,Trends Pharmacol.Sci.[药理科学趋势],第31卷(2):53-59,2010)。由于培养基的充分通气需要细胞培养物的剧烈振荡，蛋白聚集体可以在蛋白的重组表达过程中发生(Vazquez-Rey和Lang,Biotechnology andBioengineering[生物技术和生物工程],第108卷(7):1494-1508,2011)。此外，许多蛋白易于解折叠，暴露于极端pH条件下(即pH9.0或pH4.5)，随后发生聚集。包含免疫球蛋白Fc区的蛋白的典型纯化方法需要用蛋白A亲和树脂捕获蛋白，并且随后用低pH酸性缓冲液(例如pH 2.7至3.7)从树脂上洗脱(Hari等人,Biochemistry[生物化学],第49卷(43):9328–9338,2010；Ejima等人,PROTEINS:Structure,Function,and Bioinformatics[蛋白：结构、功能、和生物信息学],第66卷:954–962,2007)。低pH洗脱不仅诱导蛋白聚集，从而导致产率降低，而且还可能损害回收的非聚集蛋白的长期稳定性。

为了避免由对蛋白A树脂进行低pH洗脱产生的不良效应，开发了温度响应性蛋白A树脂作为常规蛋白A树脂的替代物。这种新树脂由蛋白A的突变体形式组成，其在低于10℃的温度与免疫球蛋白的Fc区结合，但在升高的温度(例如40℃)对Fc区失去亲和力(Koguma等人,Journal of Chromatography A[色谱学杂志A辑],第1305卷:149-153,2013)。最初，人们怀着极大的热情接受了温度响应性蛋白A树脂，因为它允许通过简单地加热柱在中性pH下从树脂中洗脱含有Fc区的蛋白(Koguma等人,Journal of Chromatography A[色谱学杂志A辑],第1305卷:149-153,2013)。虽然用温度响应性蛋白A树脂纯化蛋白会产生稳定的分子，但这种方法是不切实际的，因为它需要从柱加载到洗脱使柱温改变30℃或更高，因此在加载和洗脱步骤之间产生显著的延迟时间。操纵柱温需要的时间延迟为纯化操作增加了大量的循环时间，从而使得这种方法对于大规模制造过程和在发现阶段期间大组的蛋白的高通量纯化而言都是不可取的。此外，大范围温度波动对从温度响应性蛋白A树脂洗脱的蛋白稳定性的影响仍然未知。

因此，本领域需要针对含有Fc区的蛋白的有效纯化方法，所述方法使得对与先前蛋白A色谱法相关的蛋白的结构完整性的影响最小化或降低。

发明内容