[发明专利]利用基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物检测内毒素的方法

说明书

本发明涉及使用显色测定法检测样品中内毒素的方法，该方法包括：(a)使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；(b)测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应；其中LAL基本上不含凝固蛋白原。该方法还涉及包含基本上不含凝固蛋白原的LAL的组合物和试剂盒，以及制备它们的方法。

发明领域

本发明涉及使用显色测定法检测样品中内毒素的方法，该方法包括：(a)使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；(b)测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应，其中LAL基本上不含凝固蛋白原。该方法还涉及包含基本上不含凝固蛋白原的LAL的组合物和试剂盒，以及制备它们的方法。

背景技术

革兰氏阴性菌内毒素是一种生物热原，当其被引入静脉内时引起发热。内毒素，也称为脂多糖(LPS)，存在于革兰氏阴性菌的外膜中，例如沙门氏菌(Salmonella)，大肠杆菌(Escherichia coli)，志贺氏菌(Shigella)和奈瑟氏菌(Neisseira)。内毒素引发的毒性机制是由脂多糖的脂质部分引起的。例如，当生物体内的细菌发生溶解时，进入血流的脂质的反应可以一直到补体系统的激活。该脂质部分导致不同细胞因子的释放，例如白细胞介素1和8。肿瘤坏死因子的产生也可以被激活。产生的感染与炎症过程有关，并且可能对感染的生物体构成很大的危险。白细胞介素1是生物体作为免疫反应和对抗炎症而释放的一系列细胞因子。该信号导致嗜中性粒细胞向感染发生的地方迁移，产生趋化性。这有利于吞噬作用的发生；然而，在某些情况下，根据个体免疫系统的状态和感染程度，内毒素可能导致全身性脓毒血症，以及脓毒血症带来的风险。众所周知，在许多情况下，革兰氏阴性菌在高等哺乳动物中引起多器官衰竭甚至全身感染导致死亡。由于与内毒素相关的不利影响，制药行业和医疗保健界对内毒素的早期和敏感检测至关重要。

鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)试验在20世纪70年代作为检测内毒素的方法在商业上引入。LAL衍生自蝎鲎(horseshoe crab)，美洲鲎(Limulus polyphemus)的血细胞或阿米巴样细胞。最初的LAL测试构成了丝氨酸蛋白酶的级联，其由痕量水平的内毒素触发，在反应结束时达到凝胶凝块。因子C通常作为酶原存在，是该凝血级联的引物。在体内，因子C是完美的生物传感器，它提醒蝎鲎存在革兰氏阴性入侵者。止血终点诱捕入侵者，杀死它并限制进一步的感染。

可以改良LAL测试以使用不同的方法来测量阿米巴样细胞对内毒素的反应。这些方法包括所谓的凝胶-凝块法，比浊法和显色法。在国际药典中推荐这些LAL测试作为检测用于生产药物和最终产品的原料中的细菌毒素的方法。这些测试对于化妆品工业和食品生产也是有用的，因为它是FDA(食品和药品管理局)推荐的用于检测热原的方法。

发明概述

本文提供了使用显色测定法检测样品中的内毒素的方法，所述显色测定法包含基本上不含凝固蛋白原的鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)。

本文的实施方式涉及使用显色测定法检测样品中的内毒素的方法，该方法包括：(a)使样品与包含鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和显色底物的试剂接触；(b)测量在样品中存在内毒素时由显色底物的变化引起的显色效应，其中LAL基本上不含凝固蛋白原。

在一些实施方式中，显色底物是共价键合至多于三个氨基酸的对＝硝基苯胺。在一些实施方式中，显色底物是Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA。在一些实施方式中，由于酶促反应导致显色底物的变化。在一些实施方式中，酶促反应是从多肽切割发色团。在一些实施方式中，通过检测380nm-420nm处的吸光度来测量显色效应。在一些实施方式中，通过检测405nm处的吸光度来测量显色效应。

在一些实施方式中，试剂是液体。在一些实施方式中，试剂是水性液体。在一些实施方式中，将试剂冻干，然后在与样品接触之前在水性液体中重建。

在一些实施方式中，将LAL冻干，然后在与样品接触之前重建。在一些实施方式中，将显色底物冻干，然后在与样品接触之前重建。