[发明专利]通过杂交找到低丰度序列(FLASH)的方法

权利要求书

1.一种样品分析方法，其包括：

(a)使用靶向目标序列的多种重编程的核酸指导的内切核酸酶消化末端封端的混合核酸样品以产生消化样品，其中所述消化样品中至少一些片段包含：(i)目标序列和(ii)至少一个通过内切核酸酶切割产生的可连接末端；

(b)富集含有所述目标序列的片段；以及

(c)分析所述富集的片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括将衔接子连接至步骤(a)中所述通过内切核酸酶切割产生的可连接末端。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述衔接子包含捕获部分，并且所述富集是通过将所述捕获部分与载体结合并洗去未结合的核酸来进行。

4.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中(a)中所述内切核酸酶消化产生在限定大小范围内的片段。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述富集是通过选择所述片段的大小来进行。

6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中(a)中所述内切核酸酶消化产生两端均可连接的片段。

7.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中(a)中消化产生在两端具有可连接的内切核酸酶切割位点的片段，并且所述方法包括将衔接子连接到所述片段的两端。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述富集是通过使用与所述衔接子或其补体杂交的引物扩增所连接的片段来进行。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述衔接子含有分子索引器。

10.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括将编索引的衔接子连接到所述片段的两端，其中所述索引是一系列随机核苷酸，其长度足以使每个片段有较高概率接受不同索引；对所连接的片段测序以产生序列读段；然后对与所述序列读段中的目标序列相联的分子索引器序列的数量进行计数，从而提供所述核酸样品中所述目标序列的拷贝数的估计值。

11.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括：

(a)单独地：

(I)使用靶向目标序列的多种重编程的核酸指导的内切核酸酶消化所述混合核酸样品的第一部分，以产生第一消化样品，其中所述消化样品中的至少一些片段包含：(i)第一目标序列和(ii)至少一个通过内切核酸酶切割产生的可连接末端；

(II)使用靶向目标序列的多种重编程的核酸指导的内切核酸酶消化所述混合核酸样品的第二部分，以产生第二消化样品，其中所述消化样品中的至少一些片段包含：(i)第二目标序列和(ii)至少一个通过内切核酸酶切割产生的可连接末端；

其中所述第一消化样品中的至少一些片段与所述第二消化样品中的至少一些片段重叠；

(b)富集含有所述目标序列的片段；

(c)对所富集的序列进行测序以产生多个序列读段；以及

(d)组装重叠的序列读段，从而获得第一目标序列和第二目标序列的重叠群。

12.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述通过内切核酸酶处理产生的可连接末端是平末端。

13.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合核酸样品包含来自至少两种生物的DNA。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少两种生物包含哺乳动物和病原体。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述病原体是病毒、细菌或真菌。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少两种生物包含哺乳动物和微生物菌群。