[发明专利]通过杂交找到低丰度序列(FLASH)的方法

说明书

提供了一种样品分析方法。在一些实施例中，所述方法包括：(a)使用靶向目标序列的多种重编程的核酸指导的内切核酸酶消化混合核酸样品以产生消化样品，其中所述消化样品中至少一些片段包含：(i)目标序列和(ii)至少一个通过内切核酸酶切割产生的可连接末端；(b)富集含有所述目标序列的片段；以及(c)分析所述富集的片段。还提供了用于执行所述方法的试剂盒。

交叉引用

本申请主张2016年8月16日提交的美国临时申请序列号62/375,789的权益，该申请通过引用并入文中。

背景技术

目前用于富集复杂核酸文库中的低丰度序列的方法通常涉及多重PCR或与标记的寡核苷酸的杂交。这两种方法效率低，难以实施，优化成本高，并且在给定样品中可以富集的序列数量有限。

一直需要用于富集核酸样品中低丰度序列的新颖方法。

发明内容

本文描述的是称为通过杂交找到低丰度序列或“FLASH”的方法，一种在测序或其它分子计数应用前使用序列特异性核酸酶(例如CRISPR/Cas9)来切割DNA文库或其它样品中的特定目标位点的技术。在一些实施中，然后将新暴露的DNA末端自由连接到允许他们被扩增的特定衔接序列。在这些实施例中，仅使用对衔接子特异的一对引物的单个PCR步骤因此可以以完全可编程的方式扩增数百、数千或可能数百万种不同的序列。在一些情况下，为了减少非靶向分子的测序，可以封端DNA来源中DNA分子的末端，例如用磷酸酶处理或在核酸酶消化之前使用另一种方法来封端任何已经可及的DNA末端。

在一些实施例中，所述方法可以包括：(a)用多种重编程的核酸指导的内切核酸酶消化末端封端的(例如，磷酸酶处理的)混合核酸样品，所述内切核酸酶靶向目标序列以产生消化的样品，其中消化的样品中的至少一些片段包含：(i)目标序列和(ii)至少一个通过内切核酸酶切割产生的可连接末端；(b)富集含有目标序列的片段；以及(c)分析富集的片段。

还提供了用于执行所述方法的试剂盒。

附图说明

当结合附图阅读时，将最好地理解以下详细描述的某些方面。需要强调的是，根据惯例，附图的各种特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，各种特征的尺寸被任意扩大或缩小。附图中包括以下图：

图1显示了FLASH方法的一些原理。

图2显示了不同的FLASH池(由空心和实心三角形表示)如何用于将具有重叠片段的所需DNA片段(实心条)片段化。可以使用不同的FLASH池(由空心和实心三角形表示)来将具有重叠片段(散列条)的所需DNA片段(实心条)片段化。重叠区域可以靶向SNP、易位或侧翼重复序列的区域。这些重叠片段可以在文库制备之前组合，然后用于组装测序读数。

图3图A显示来自i)甲氧西林敏感性金黄葡萄球菌(MSSA)的培养分离物，ii)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和iii)直接来自MRSA肺炎患者的BAL液的mecA丰度。来自MRSA肺炎患者的BAL液中可检测的mecA随着FLASH而增加。面板B显示FLASH允许检测来自MRSA和铜绿假单胞菌肺炎患者的BAL液中的氟喹诺酮抗性突变GyrA S84L。

图4描述了该方法的另一种形式，其中封端的衔接子与片段化DNA连接，防止聚合酶扩增，除非靶向切口酶(例如具有单个活性位点突变D10A的Cas9)产生允许置换衔接子的封端链的单链切割。结果是仅扩增含有两个切口酶位点的插入物。

定义

在更详细地描述示例性实施例之前，阐述以下定义以说明和定义说明书中使用的术语的含义和范围。

数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则核酸以5'至3'方向从左向右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左向右书写。