[发明专利]核酸反应及相关方法和组合物

说明书

本发明涉及通过PCR检测核酸分析物的方法。特别地，提供了用于检测多种核酸分析物并产生动力学特征的方法和试剂盒。进一步提供了使用限制性引物的巢式PCR和PCR的方法和试剂盒。

交叉引用

本申请要求于2016年6月17日提交的第62/351,411号美国临时申请的权益，该临时申请通过引用以其全文并入本文。

背景技术

聚合酶链反应是一种用于增加核酸靶标的量的技术。通过使短引物序列、游离核苷酸和DNA聚合酶的反应混合物进行热循环，可以复制模板链。对于聚合酶链反应(PCR)，通常需要以下温度平台：用于使感兴趣的扩增子变性的高温、用于使引物与模板结合的低温和用于合成互补链的中间温度。

引物与模板之间的结合的特异性允许选择性地扩增预期靶标。例如，典型的定量聚合酶链反应进行到“饱和”，其中扩增反应进行到至少一种反应物(如引物、聚合酶、探针或游离核苷酸)耗尽的点。当使用诸如TaqMan探针、FRET探针或嵌入染料等荧光报道分子来说明DNA扩增的程度时，可生成荧光曲线。当报道探针浓度以不断增加的速率耗尽时，经常出现“饱和”荧光曲线的S形特征。

然而，该反应(以及引申而言，其特征荧光)受到包括PCR引物在内的所有反应物浓度的限制。例如，当使用等浓度的单组引物时，并且当一种引物比另一种引物更有效地延伸时，该反应变成速率限制性的。与DNA的指数扩增相比，这导致DNA的线性扩增。

发明内容

在一些实施方案中，本文描述了检测样品中靶核酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：a)对所述样品进行扩增反应；b)测量在所述扩增反应期间生成的信号并从所测量的信号生成动力学特征；以及c)将所生成的动力学特征与参考特征进行比较，并确定所述生成的动力学特征是否对应于所述参考特征，从而检测所述样品中靶核酸分析物的存在或不存在。在一些实施方案中，动力学特征包括选自电磁信号、波长和荧光发射信号的信号。在一些实施方案中，所述动力学特征被绘制为曲线。在一些实施方案中，所述曲线包含指数区域、线性区域和平台区域中的至少一种。在一些实施方案中，所述动力学特征包括记录值。在一些实施方案中，将所述值记录在表中。在一些实施方案中，所述扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述参考特征对应于通过在一组受限扩增参数的一个或多个成员下扩增所述靶核酸分析物而生成的动力学特征。在一些实施方案中，该组受限扩增参数包括以下参数的任何组合：(i)正向和/或反向引物浓度的范围；(ii)聚合酶浓度的范围；(iii)聚合酶类型；(iv)核苷酸浓度的范围；(v)发色团浓度；和(vi)发色团类型；(vii)热循环数；(viii)热循环速率；(ix)一种或多种热循环阶段温度；和(x)一种或多种热循环阶段时间长度；(xi)靶标特异性分子探针的范围；(xii)与一种或多种靶标特异性探针相关的引物；以及(xiii)一种或多种酶辅因子的浓度。在一些实施方案中，所述扩增反应在一个或多个所述受限扩增参数内进行。