[发明专利]工程化的靶特异性核酸酶

权利要求书

1.一种工程化的FokI裂解半结构域，其中所述工程化的裂解半结构域包含残基393、394、398、416、421、422、442、444、472、473、478、480、525或530中的一种或多种突变，或者其中位置418处的野生型残基被Glu(E)或Asp(D)残基置换，位置446处的野生型残基被Asp(D)残基置换，位置448处的野生型残基被Ala(A)残基置换(K448A)，位置479处的野生型残基被Gln(Q)或Thr(T)残基置换(I479Q或I479T)，位置481处的野生型残基被Ala(A)、Asn(N)或Glu(E)残基置换(Q481A、Q481N、Q481E)，或者位置523处的野生型残基被Phe(F)残基置换，其中所述氨基酸残基相对于如SEQ ID NO：1中所示的全长FokI野生型裂解结构域编号。

2.如权利要求1所述的工程化的裂解半结构域，其包含残基416和422处的突变、位置416处的突变和K448A、K448A和I479Q、K448A和Q481A和/或K448A、以及位置525处的突变。

3.如权利要求2所述的工程化的裂解半结构域，其中位置416处的野生型残基被Glu(E)残基置换(R416E)，位置422处的野生型残基被His(H)残基置换(R422H)，并且位置525处的野生型残基被Ala(A)残基置换。

4.如权利要求1至3中任一项所述的工程化的裂解半结构域，其还包含位置432、441、483、486、487、490、496、499、527、537、538和559中的一个或多个处的额外氨基酸突变。

5.一种异二聚体，其包含如权利要求1至4中任一项所述的第一工程化的裂解半结构域和第二裂解半结构域。

6.一种人工核酸酶，其包含如权利要求1至4中任一项所述的工程化的裂解半结构域和DNA结合结构域。

7.如权利要求6所述的人工核酸酶，其中所述DNA结合结构域包含锌指蛋白、TALE效应物结构域或单指导RNA(sgRNA)。

8.如权利要求7所述的人工核酸酶，其中所述锌指蛋白包含在位置-14、-9和-5处的一种或多种突变。

9.一种多核苷酸，其编码如权利要求1至4中任一项所述的工程化的裂解半结构域、如权利要求5所述的第一工程化的裂解结构域和第二工程化的裂解结构域或如权利要求6至8中任一项所述的人工核酸酶。

10.一种分离的细胞，其包含如权利要求9所述的多核苷酸。

11.一种用于裂解目标区域中的基因组细胞染色质的方法，所述方法包括：

在细胞中表达包含根据权利要求6至8中任一项所述的工程化的裂解结构域的人工核酸酶，

其中所述核酸酶位点特异性地裂解所述基因组细胞染色质的目标区域中的核苷酸序列。

12.如权利要求11所述的方法，其还包括使所述细胞与供体多核苷酸接触；其中所述细胞染色质的裂解促进所述供体多肽与所述细胞染色质之间的同源重组。

13.一种裂解基因组细胞染色质中的至少两个靶位点的方法，所述方法包括：

裂解基因组细胞染色质中的至少第一靶位点和第二靶位点，其中使用包含根据权利要求6至8中任一项所述的人工核酸酶的组合物裂解每个靶位点。

14.一种分离的细胞或细胞系，其包含通过根据权利要求6至8中任一项所述的人工核酸酶产生的至少一种位点特异性基因组修饰。