[发明专利]工程化的靶特异性核酸酶

说明书

本文描述了工程化的核酸酶，所述工程化的核酸酶包含裂解结构域(例如，FokI或其同源物)和/或DNA结合结构域(锌指蛋白、TALE、单指导RNA)中的突变，以使得中靶特异性提高。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年8月24日提交的美国临时申请No.62/378,978和2017年1月9日提交的美国临时申请No.62/443,981的权益，所述临时申请的公开内容特此以引用的方式整体并入。

发明权利声明

在联邦资助的研究下进行

不适用。

技术领域

本公开涉及多肽和基因组工程化以及同源重组的领域。

背景技术

诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、具有工程化crRNA/tracr RNA(‘单指导RNA’)的CRISPR/Cas系统(也称为RNA指导的核酸酶)和/或基于Argonaute系统的核酸酶(例如，来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，被称为‘TtAgo’(Swarts等人(2014)Nature 507(7491)：258-261)的人工核酸酶包含与裂解结构域缔合或可操作连接的DNA结合结构域(核苷酸或多肽)并且已用于基因组序列的靶向改变。例如，核酸酶已用于插入外源序列，使一种或多种内源基因失活，产生基因表达模式改变的生物体(例如作物)和细胞系等等。参见例如，美国专利No.9,255,250；9,200,266；9,045,763；9,005,973；8,956,828；8,945,868；8,703,489；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公布20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960以及20150056705。例如，核酸酶对(例如，锌指核酸酶，TALEN，dCas-Fok融合体)可用于裂解基因组序列。所述对中的每个成员通常包括连接至核酸酶的一个或多个裂解结构域(或半结构域)的工程化(非天然存在的)DNA结合蛋白。当DNA结合蛋白结合至其靶位点时，连接至那些DNA结合蛋白的裂解结构域被定位成使得基因组的二聚化和随后裂解可发生。

通常，分子间离子对(盐桥)对于许多DNA-蛋白质相互作用是必需的。通常，带电荷的氨基酸侧链(即-NH3+、＝NH2+)与DNA主链的带负电荷的磷酸根基团相互作用以形成盐桥。这些离子对可以是非常动态的，并且可在两种离子之间插入溶剂(例如水分子)时在两种离子的直接配对与为‘溶剂分离的离子对’的配对之间交替(Chen等人(2015)J PhysChem Lett 6：2733-2737)。