[发明专利]用于测量细胞中离子通道活性的组合物和方法

说明书

描述用于检测细胞中离子通道的活性的组合物和方法。所述方法包括向所述细胞提供上样缓冲溶液，其中所述上样缓冲液包括铊离子指示剂和任选的氯离子，并向所述细胞提供包括铊离子的刺激缓冲液。提供所述刺激缓冲液可使铊离子通过所述离子通道流入或流出所述细胞。在提供所述刺激缓冲液后，检测响应于铊流入或流出的所述铊离子指示剂的至少一种光学特性的变化，从而检测所述离子通道的所述活性。

技术领域

描述了用于测量细胞中离子通道的活性的组合物、方法和试剂盒。

背景技术

铊离子流入可用作负载有钙离子指示剂苯并噻唑钙乙酰氧基甲基(BTCAM)酯或铊敏感性荧光染料的克隆细胞系中钾离子通道活性的替代指示剂。目前用于监测钾离子通道的测定使用铊(I)离子，所述铊(I)离子选择性地进入开放的钾通道并且与BTC结合，从而给出钾离子通道活性的光学读数。此方法可用于研究从化合物库中以高通量筛选(HTS)模式测试的药品对离子通道的激活和/或抑制。然而，基于结合到BTC的方法具有明显的缺点。即，当在氯离子存在下执行测定时，铊(I)离子形成氯化铊(TlCl)，所述氯化铊(TlCl)可溶性差并且将在约4.5mM或更大的浓度下从溶液中沉淀出来。因此，用于实施BTC的当前方法的缓冲液应基本上不含氯离子，以防止TlCl从溶液中沉淀出来以产生不一致的数据。因此，当前方法需要附加步骤：洗涤和去除缓冲液，其中细胞通常在培养物(例如，含有氯离子的缓冲液)中生长。此外，由于在这些测定中不存在氯化物，因此可将测定视为不接近生理条件。

作为BTC的替代方案，可使用对铊离子的存在敏感的荧光染料来监测钾离子通道和转运体活性的HTS。在这种基于荧光的测定中报告的荧光信号可作为钾离子通道或透过铊离子的转运体的活性的替代读数。在此处，细胞负载有非荧光的铊离子敏感染料。将待筛选的药品与细胞预孵育，并将微板加载到读数器中，其中它们被注射含有低水平铊离子的刺激缓冲液。铊离子自由地流动通过开放的钾通道，充当K+的替代物。当刺激钾通道时，铊流动到细胞中并结合荧光染料，从而产生与生理盐水条件下的通道活性成比例的荧光信号。然而，现有荧光染料面临的问题是它们对于在HTS测定中检测非常低水平的铊(例如，低于约100-500μM)不够灵敏。因此，需要改进的高度敏感的化合物，所述化合物即使在生理相关条件下的非常低的浓度下也能定量检测铊离子。另外，现有的荧光化合物发出通常在HTS测定中可干扰其它荧光组分(如例如绿色荧光蛋白)的光。因此，需要用于HTS测定的新荧光化合物，所述新荧光化合物在用于监测离子通道活性时响应于金属离子(如铊)的存在而在可见波长范围上发出光。由于存在来自药品库中化合物的绿色自发荧光，还需要在FITC/绿色光学通道外部的传感器。已知自发荧光遮挡和/或混淆在此通道中进行的测量。因此，需要在GFP/FITC通道外部吸收和发出光并提供有意义的反向屏的传感器染料，所述反向屏用于证实在GFP/FITC屏中的“命中”以及发现潜在治疗剂，否则所述潜在治疗剂的活性被内在的绿色通道荧光掩盖。

发明内容

在一个方面，提供用于检测细胞中钾离子通道的活性的方法，其包括：a)使细胞与上样缓冲液接触，其中细胞包含钾离子通道，其中上样缓冲液包含铊离子指示符；b)向细胞施加刺激缓冲液，其中刺激缓冲液包含铊离子，从而使铊离子通过钾离子通道流入细胞；和c)测量响应于铊流入的铊离子指示剂的至少一种光学特性的变化，从而检测钾离子通道的活性，其中铊离子指示剂具有如以下表示结构：

其中R₂＝H，并且R₁＝

或其中R₁＝H并且R₂＝