[发明专利]用于从人类血浆开始的纤溶酶原纯化的工艺

说明书

本发明提供了一种用于从人类血浆或其分离中间体开始来产生人类纤溶酶原的工艺。该工艺的主要阶段是：病毒灭活的步骤，其中使人类血浆与溶剂/洗涤剂混合物接触；单亲和色谱步骤；以及病毒去除纳米过滤步骤。此工艺可被放大至工业水平，并且在不添加任何蛋白酶抑制剂的情况下，该工艺提供功能化且完整的最终产品，所述最终产品适合于被施用用于治疗由于遗传性纤溶酶原缺乏症引起的人类疾病。

发明领域

本发明涉及血液产品的领域，特别地涉及人类纤溶酶原的纯化和生产。

现有技术

纤溶酶原(Plasminogen)(Pg)作为血浆酶原被合成，并且通过生理活化剂尿激酶(physiological activators urokinase)(uPA)或组织纤溶酶原活化剂(tissueplasminogen activator)(tPA)被转化成丝氨酸蛋白酶纤溶酶(Pm)，这造成纤溶系统的活化。事实上，Pm的主要体内功能是通过降解含纤维蛋白的血栓来调节血管效力(vascularpotency)。

合成纤溶酶原的主要组织是肝，然而其他来源已经被确定；它们包括肾上腺、肾、脑、睾丸、心脏、肺、子宫、脾、胸腺以及肠道。纤溶酶原作为810个氨基酸多肽被合成；纤溶酶原的天然形式具有NH₂-末端谷氨酸，并且它被称为Glu-Pg。纤溶酶原(791个氨基酸)的成熟形式是由于在分泌期间19个氨基酸前导肽(amino acid leader peptide)的裂解(cleavage)。人类纤溶酶原转化成纤溶酶涉及Arg⁵⁶¹-Val⁵⁶²键的裂解，这导致Glu-Pm的产生，Glu-Pm包含561个氨基酸的N-末端重链和230个氨基酸的二硫连接的羧基末端(disulfide-linked carboxy-terminal)轻链。纤溶酶催化77位的N-末端Glu¹-Pg的水解，这将Glu¹-Pg转化成被称为Lys⁷⁸-Pg的另一种纤溶酶原形式。此转化对于细胞表面上的Glu-Pg活化的最大增强是重要的。

25年前，首次记录在案的异常人类纤溶酶原在对于具有血栓形成事件的历史的纤溶酶原缺乏(plasminogen deficiency)杂合的患者中被报告。纤溶酶原基因中的纯合突变或复合杂合突变(compound heterozygous mutation)引发严重的炎症，当影响被称为木质样结膜炎(ligneous conjunctivitis)或伪膜性疾病的角膜时威胁视力功能，并且在某些情况下引发闭塞性脑积水。

先前已经描述了若干种与纤溶酶原纯化相关的方法。

Deutsch D.G.和Mertz E.(Science 1970,170,1095-1096)描述了基于使用赖氨酸-琼脂糖4B树脂(Lysine-Sepharose 4B resin)的亲和色谱法从人类血浆中的纤溶酶原纯化的方法。使340mL的体积的血浆(用水稀释至640mL)穿过150mL的树脂，用0.3M磷酸盐缓冲液和3mM EDTA洗涤，并且纤溶酶原的洗脱用0.2Mε-氨基己酸进行，ε-氨基己酸在冷中通过Sephadex G-25柱除去。

Grant A.J.(Biochem.Int.1990,20(3),519-527)描述了在类似于Deutsch和Mertz的条件下，基于双亲和色谱法(double affinity chromatography)的方法。该工艺在4℃，通过在每个纯化步骤中添加蛋白酶抑制剂来进行，以便防止通过血浆中存在的活化剂，纤溶酶原自发活化成纤溶酶。

US3943245描述了通过使用琼脂糖-L-赖氨酸与高离子强度缓冲溶液的改性的亲和色谱法，从人类和非人类血浆或Cohn级分III中纯化纤溶酶原，如在离子交换色谱法中一样。