[发明专利]单细胞中细胞内或表面分子靶标的多重检测

说明书

本公开展示了一种方法，该方法将合成的DNA遗传密码翻译成在纳升微腔中记录的空间代码，用于在单细胞中多重测定几乎任何类型的分子靶标(例如，miRNA、mRNA、细胞内和表面蛋白质)。

相关申请

本申请要求2016年7月18日提交的美国临时申请号62/363,696的优先权，该文献的全部内容通过引用并入本文。

政府支持

本发明是在美国国立卫生研究院授予的批准号5U01CA164252和国立癌症研究所授予的批准号R21CA17739301的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

背景

在单细胞水平上进行分子靶标的多重检测一直是具有挑战性的。尽管最近取得了进展，但大量细胞计数需要复杂且昂贵的分析。特别地，如果样品大小有限(例如，几千个细胞)，则难以进行大量细胞计数。大量细胞计数也限于蛋白质靶标的检测。迄今为止，还没有技术能够以高度多重的方式在单个细胞中检测多种类型的分子靶标。

概述

本公开提供了可用于蛋白质和/或核酸(例如RNA或DNA)靶标(例如，细胞内靶标)的多重检测的方法、系统、试剂盒、装置和组合物。该技术可用于将合成核酸(例如，DNA)密码子翻译成纳升微腔中记录的空间和光谱代码，例如，用于在单个细胞中多种类型的分子靶标(例如，miRNA、mRNA、细胞内和表面蛋白质)的多重测定。本公开的可检测报告构建体的空间位置和光谱性质都与特定的目标分子靶标和特定的单个细胞相关。因此，该技术为系统生物学、细胞信号传导和基因组学领域中的单细胞、高通量、蛋白质和/或核酸的多重检测，以及例如用于抑制或激活信号传导途径或基因表达的治疗剂的开发提供了有效且划算的手段。

作为非限制性实例，本文提供的技术可用于单细胞中microRNA(miRNA)生物标志物的高通量、多重检测。miRNA是一类小的非编码RNA，通常作为负基因调节因子起作用。许多miRNA位于染色体的脆弱区域内，这些区域是与人类癌症更紧密相关的基因组区域，表明miRNA在肿瘤发展中的可能作用。miRNA表达谱与各种癌症相关，并且miRNA特征是潜在的独特癌症生物标志物，用于准确诊断和分类人类癌症。然而，人类癌症是高度异质的，部分原因在于单细胞水平的高度瘤内异质性。因此，表征这些人类癌症可能需要评估大量单个肿瘤细胞，每个肿瘤细胞具有其自身的miRNA表达谱。本文提供的方法、系统、试剂盒、装置和组合物能够在单细胞中进行高通量和多重miRNA检测，而无需进行长度扩增过程。更具体地，在一些实施方案中，该技术将条形码核酸阵列和分子缀合物与纳升微流体平台(例如，芯片)整合在一起，能够从大量单个癌细胞中多重检测许多(例如，至少5,10,12,15,20,30,40或50个)miRNA生物标志物(或其他细胞内生物标志物)。该技术不仅是用于检测涉及多种人类癌症的miRNA生物标志物的通用平台，而且还可用于检测来自单细胞的其他非编码RNA和信使RNA生物标志物。

因此，本公开内容提供的方法包括(a)使包含核酸靶标的细胞与至少两种(例如，至少3种，至少4种，至少5种，至少10种，至少20种，或至少50种)缀合物接触，每个缀合物包含与(ii)核酸报告链通过(iii)可切割接头连接的(i)核酸诱饵链，其中核酸诱饵链含有与目标核酸靶标互补的核苷酸序列，以产生包含靶共轭复合物的修饰细胞，(b)将步骤(a)的修饰细胞加载到含有微孔的基板(例如微芯片)上(或在溶液中含有少量细胞的其它方法)，以产生负载的基板。

本文还提供了包括(a)使包含蛋白质靶标的细胞与至少两种(例如，至少3种，至少4种，至少5种，至少10种，至少20种，或至少50种)缀合物接触的方法，每个缀合物包含与(ii)核酸报告链通过(iii)可切割接头连接的(i)抗体，其中所述抗体与目的蛋白质靶标特异性结合，以产生包含靶缀合物复合物的修饰细胞，(b)将步骤(a)的修饰细胞加载到含有微孔的基板(例如微芯片)上(或在溶液中含有少量细胞的其它方法)，以产生负载的基板基板。