[发明专利]在丝状真菌细胞中选择性碳源非依赖性表达蛋白质编码序列的方法

说明书

本发明涉及一种在丝状真菌细胞中选择性碳源非依赖性表达蛋白质编码序列的方法以及这种启动子用于在丝状真菌细胞中选择性碳源非依赖性表达蛋白质编码序列的用途。

技术领域

本发明涉及一种在丝状真菌细胞中选择性碳源非依赖性表达蛋白质编码序列的方法，以及这种启动子用于在丝状真菌细胞中选择性碳源非依赖性表达蛋白质编码序列的用途。

背景技术

丝状真菌广泛用于农业生物化学过程，比如纤维素或木质纤维素材料的水解，其例如在生物乙醇生产过程中用作生物质底物。此外，这种水解产物还可以作为生产许多有机化合物比如乳酸的底物，因此有效和可控的水解是现有技术中长期形成的需求。由于水解强烈依赖所述丝状真菌的水解酶的产生和所产生的酶的各自的产率或浓度，因此长期以来还需要在所需时间启动或停止某种酶的表达。

还需要使用强启动子，使得可以在某一时间获得足够水平的目标蛋白质。在本领域内，使用由例如Li等(Achieving efficient protein expression in Trichodermareesei by using strong constitutive promoters；Microbial Cell Factories,2012，11：84)描述的组成型启动子。然而，优选使用所谓的诱导型启动子，其能够在某一时间启动或停止目标基因的转录，这通常与例如木质纤维素材料的复杂水解过程中的某些工艺步骤有关。由于源自丝状真菌的启动子通常不依赖于底物，因此难以控制转录，目前在实践中可用于在丝状真菌中控制目标基因转录的诱导性启动子只有相对有限的选择。如果使用的启动子不是底物非依赖性的，那么存在于所述底物中或在水解过程中由其他酶产生的化合物将影响酶的转录，使得控制变得不可能。

此外，这些启动子不仅需要是可控的，还需要表现出足够的表达效率和良好的表达率。理想地，表达应在诱导条件下达到高水平，并且应该能够在非诱导条件下被完全阻断。

发明内容

现在本发明的发明人惊奇地发现这些需求可以通过在丝状真菌细胞中选择性碳源非依赖性表达蛋白质编码序列的方法来解决，所述方法包括以下步骤：

a)向丝状真菌细胞中引入长度为1550个碱基对(bp)的启动子，所述启动子包含序列模式X₁X₂X₃X₄tX₅X₆tcX₇X₈，其中X₁为g、t或c，X₂为a、g、t或c，X₃为c或t，X₄为c或t，X₅为g、a、c或t，X₆为c或t，X₇为c或a，X₈为c或t；

b)使含有所述启动子的所述丝状真菌细胞与生长培养基接触；

c)向所述生长培养基添加至少一种有机酸。

术语“碳源非依赖性表达”应理解为任何由化合物或物质启动的蛋白质编码序列的表达，所述化合物或物质不包含在用于所述丝状真菌生长的碳源(生长培养基)中或包含在用于所述丝状真菌生长的碳源(生长培养基)中但其浓度比所述碳源低至少两个数量级。

术语“表达”应理解为来自基因(在本申请中“所述蛋白质编码序列”)的信息用于合成功能性基因产物即蛋白质的过程。所述基因表达的过程被所有已知的生命——真核生物(包括多细胞生物)、原核生物(细菌和古细菌)采用，并被病毒利用——以生成生命所需的大分子机器。

在本发明的范围内，术语“碳源非依赖性表达”特别用于任何蛋白质的表达，所述蛋白质不是启动于或独立来自于用于丝状真菌细胞生长的各自底物的化合物，而且也不是启动于或独立来自于生长过程中产生的任何化合物，例如所述水解过程的中间产物。因此，如本发明方法的步骤b)中所定义，向生长培养基添加至少一种有机酸以启动蛋白质编码序列的转录。