[发明专利]普氏菌属和弗朗西斯氏菌属的CRISPR1(Cpf1)的变体

说明书

靶特异性改变及改善的工程化的普氏菌属和弗朗西斯氏菌属的CRISPR 1(Cpf1)核酸酶及其在基因组工程、表观基因组工程、基因组靶向、基因组编辑和体外诊断中的用途。

优先权声明

本申请要求2016年7月26日提交的美国临时专利申请系列号62,366,976 的权益。前述文献的完整内容在此通过引用的方式并入。

联邦赞助研究或开发

本发明借助美国政府支持在国家健康研究所资助的基金编号GM105378 下做出。美国政府在本发明中享有某些权利。

技术领域

本发明至少部分地涉及靶特异性改变及改善的工程化的普氏菌属(Prevotella)和弗朗西斯氏菌属(Francisella)的CRISPR 1(Cpf1)核酸酶及其在基因组工程、表观基因组工程、基因组靶向、基因组编辑和体外诊断中的用途。

背景技术

CRISPR系统能够在多种生物和细胞类型中实现有效基因组编辑。考虑这类工具用于研究应用和治疗应用时，工程化核酸酶(包括衍生自CRISPR细菌免疫系统的那些(如Cas9和Cpf1))的全基因组特异性至关重要。

发明内容

如本文所述，可以理论上通过减少Cpf1对DNA的结合亲和力，工程化 Cpf1蛋白以显示增加的特异性。因此，本文描述了已经过工程化以显示如与野生型蛋白相比特异性增加(即，引起脱靶作用明显更少)的多种Cpf1变体，例如，来自氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)BV3L6和毛螺旋菌科 (Lachnospiraceae)细菌ND2006的变体(分别为AsCpf1和LbCpf1)，以及使用它们的方法。

在第一方面，本发明提供分离的毛螺旋菌科细菌ND2006Cpf1(LbCpf1) 蛋白，其具有表1中列出的一个或多个突变，例如，在以下一个、二个、三个、四个、五个、六个或全部七个位置处具有突变：S202、N274、N278、 K290、K367、K532、K609、K915、Q962、K963、K966、K1002和/或S1003，例如，所述蛋白包含与SEQ ID NO:1的至少氨基酸23-1246(或SEQ IDNO:1的至少氨基酸18-)的氨基酸序列至少80％相同的序列，在以下一个、二个、三个、四个、五个、六个或七个位置处具有突变：S202、N274、N278、K290、 K367、K532、K609、K915、Q962、K963、K966、K1002和/或S1003，和任选地核定位序列、细胞穿透肽序列和/或亲和标签中的一种或多种。某个突变将氨基酸改变成除天然氨基酸之外的氨基酸(例如，497是除N之外的任何氨基酸)。在优选的实施方案中，突变将氨基酸变成除天然氨基酸精氨酸或赖氨酸之外的任何氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是丙氨酸。

在一些实施方案中，变体LbCpf1蛋白包含以下一个、二个、三个或全部四个突变：S202A、N274A、N278A、K290A、K367A、K532A、K609A、 K915A、Q962A、K963A、K966A、K1002A和/或S1003A。

在一些实施方案中，变体LbCpf1蛋白还包含一个或多个减少核酸酶活性的突变，所述突变选自由表A中列出的突变组成的组，例如D832和/或E925 处、例如D832A和E925A处的突变。