[发明专利]用于快速克隆T细胞受体的组合物和方法

权利要求书

1.一种从寡克隆T细胞群体的T细胞受体克隆多种TCRα链和β链可变序列的方法，所述方法包括：

1)从所述寡克隆T细胞群体获得RNA，其中所述RNA包含编码TCRα链和β链可变序列的mRNA，并且从所述mRNA产生第一单链cDNA，其中所述第一单链cDNA包括编码所述TCRα链的单链cDNA和编码所述TCRβ链的单链cDNA，其中采用寡聚dT引物通过逆转录产生所述单链cDNA以获得从所述mRNA扩增的第一链cDNA的样品；

2)将1)中的所述样品分成第一样品和第二样品并且进行聚合酶链式反应，所述反应包括：

采用以下所有引物在所述第一样品中进行第二链cDNA合成以获得编码所述TCRβ链的双链cDNA扩增子，

采用以下所有引物在所述第二样品中进行第二链cDNA合成以获得编码所述TCRα链的双链cDNA扩增子，

3)将所述第一样品和所述第二样品与核酸外切酶孵育一段时期，以足以降解未合并到所述扩增子的引物和可能存在的单链cDNA，随后利用热处理使所述核酸外切酶失活；

4)采用标签特异性引物

HTTCR#A-ACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCTGCGGCCGCCACCATG(SEQ ID NO：1)和引物HTTCR#B-CTCAAACACAGCGACCTCGGGTGGGAACAC(SEQ ID NO：2)在所述第一样品中对编码TCRβ链的扩增子进行PCR扩增以获得所述编码TCRβ链的扩增子，其中所述编码TCRβ链的扩增子还包含限制性核酸内切酶识别位点、Kozak序列和翻译起始ATG序列；

采用标签特异性引物HTTCR#D GGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATG(SEQ ID NO：48)和HT-TCR#E AGGCAGACAGACTTGTCACTGGATTTAGAG(SEQ ID NO：49)在所述第二样品中对编码TCRα链的扩增子进行PCR扩增以获得所述编码TCRα链的扩增子，其中所述TCRα链的扩增子还包含P2A序列和起始ATG序列；和

5)将4)中的所述编码TCRβ链的扩增子和所述编码TCRα链的扩增子组装成DNA载体，以提供多种DNA载体，每种DNA载体包含编码仅一种TCRβ链和仅一种TCRα链的DNA区段，其中所述载体包含编码TCRβ链的区段和编码TCRα链的区段之间的Cβ-2A融合区段，从而提供多种DNA载体，所述多种DNA载体中的每种载体仅编码所述寡克隆T细胞群体的所述TCR的单种TCRβ链和单种TCRα链。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡克隆T细胞群体获得自癌症肿瘤。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述肿瘤包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、骨髓瘤、肉瘤、由白血病、淋巴瘤或黑素瘤形成的肿瘤，和/或其中所述肿瘤包括表达以下至少一种的免疫原性肿瘤抗原的癌细胞：NY-ESO-1、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6、HPV E7、EGFRvIII、HER2/neu、MAGE-A3、p53、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MalanA/MART1、突变Ras、gp100、蛋白酶3、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、PSA、hTERT、MAGE-A1、MAGE-A4、MAGE-C1、MAGE-C2、PLAC1、Sp17、TRP-2、周期素B1、间皮素、叶酸受体α和患者特异性新抗原。

4.根据权利要求2所述的方法，其中5)中的所述DNA载体能够在淋巴细胞中表达所述TCRα链和所述TCRβ链，使得所述淋巴细胞表现出针对由所述癌症肿瘤表达的抗原的抗原特异性。

5.根据权利要求2所述的方法，包括向淋巴细胞中引入至少一种5)中的DNA载体，并且允许由至少一种载体编码的所述TCRβ链和所述TCRα链的表达，使得所述淋巴细胞表达包含所述TCRβ链和所述TCRα链的功能性TCR。