[发明专利]用于快速克隆T细胞受体的组合物和方法

说明书

提供了用于克隆T细胞受体(TCR)的方法、组合物、重组DNA分子和试剂盒。该方法有助于从含有抗原特异性T细胞的生物样品构建TCR表达文库，所述生物样品包括但不限于肿瘤活组织检查物，其中包括冷冻的肿瘤活组织检查物。用源自文库的TCR基因工程化的外周T细胞示出有效的治疗性抗肿瘤效果。该方法可以采用任何含有T细胞的样品进行，并且可以用寡克隆T细胞群体(如已经浸润肿瘤的T细胞)进行。提供了用于第一链cDNA合成、第二链cDNA合成和用于将多种不同的TCRβ链和TCRα链克隆到多种载体中的引物组合。提供了含有载体的细胞，以及用于快速克隆TCRβ链和TCRα链的试剂盒。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年8月1日提交的美国临时申请第62/369,321号的优先权，通过引用将其公开内容合并于此。

技术领域

本公开大体上涉及用于快速克隆和表征T细胞受体的组合物和方法。

背景技术

肿瘤抗原特异性T细胞经由异二聚体T细胞受体(TCR)识别癌症靶标，而该异二聚体T细胞受体识别加载在癌细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)分子上的源自肿瘤抗原的肽。TCRα链和β链二者中的高度多样化序列(尤其是它们的补体决定区3(CDR3)中的序列)决定了MHC限制性和肽特异性。将自体肿瘤抗原特异性T细胞过继转移到癌症患者对于治疗癌症患者是有前景的治疗性策略。为了克服扩增大量的来自患者的自体肿瘤抗原特异性T细胞的局限性所带来的挑战，已经开发了具有肿瘤抗原特异性TCR基因的外周大量T细胞群体的基因工程。已经广泛证明了TCR基因工程化的T细胞具有与针对癌症靶标的亲本T细胞克隆可比较的抗肿瘤作用。测试TCR基因工程化T细胞的临床试验已经证明了其对于多种肿瘤类型具有可行性、安全性和治疗性效果。然而，仅开发了有限数量的治疗性抗肿瘤TCR基因，这限制了这种强有力的治疗性策略在癌症患者中的广泛应用。

传统上，从在体外扩增的充分表征的肿瘤抗原特异性T细胞克隆获得肿瘤抗原特异性TCRα链和β链基因。然而，以高通量方式建立靶向各类肿瘤抗原和MHC限制性元件的肿瘤抗原特异性T细胞克隆是费力且在技术上具有挑战性。最近，单细胞方法，如单细胞PCR(G.C.Wang,P.等人，Sci.Transl.Med.4,128ra142(2012)；E.Kobayashi,等人，Nat.Med.19,1542-1546(2013)；S.Seitz,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103,12057-12062(2006)；G.Dossinger,等人，PLoS One 8,e61384(2013)；A.Han,J等人，Nat.Biotechnol.32,684-692(2014))和乳液PCR((M.A.Turchaninova,等人，Eur.J.Immunol.43,2507-2515(2013)；D.J.Munson,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 113,8272-8277(2016))已经成功确定了肿瘤抗原特异性TCR对。然而，从癌症样本中获得高质量的抗肿瘤T细胞需要收集并处理相对大量的手术样本，对于所有患者而言这可能是不可行的。可替换地，已经利用下一代测序(NGS)来确定来自肿瘤样本的成对的TCRα链和β链序列((C.Linnemann,等人，Nat.Med.19,1534-1541(2013)；A.Gros,等人，Nat.Med.22,433-438(2016)；A.Pasetto,A等人，CancerImmunol.Res.4,734-743(2016)；B.Howie,等人，Sci.Transl.Med.7,301ra131(2015))。在该方法中，获得了几乎完整的肿瘤浸润性T细胞的TCRα序列和β序列，并且基于每个样本中的匹配频率预测了TCRα链和β链基因的配对。然而，采用该方法估计TCR基因的绝对频率仍然具有挑战性，因为存在显著比例的T细胞表达两种TCRα链基因(Padovan等人，Science262,422-424(1993))。此外，在基于单细胞和基于NGS的方法中，对于许多候选对，终点结果通常是配对TCR基因序列。然后，需要多种繁琐程序(如合成TCR表达盒、表达载体中克隆和测试针对靶抗原的反应性)以确定治疗性TCR基因候选物。总而言之，快速确定肿瘤反应性TCR基因以用于个体化过继性T细胞疗法仍然存在重大挑战。因此，对于快速确定肿瘤反应性TCR基因的改进方法，存在持续和未满足的需求。本公开与此需求相关。