[发明专利]用于选择产生多肽的细胞的改进方法

说明书

本文报道按5’至3’方向包含以下的核酸：i)不含符合读框的翻译终止密码子的编码目的多肽的第一核酸片段，ii)与该第一核酸片段有效连接的第二核酸片段，其始于5免疫球蛋白重链C_H3或C_H4结构域的5’剪接供体位点，终止于后面的免疫球蛋白重链跨膜结构域外显子M1的3’剪接受体位点，且包含符合读框的翻译终止密码子和聚腺苷酸化信号，和iii)与该第二核酸有效连接的第三核酸片段，其编码跨膜10结构域的至少一个片段，其中第二核酸片段在其3’端具有核苷酸序列CTACCACCCCCTTCCTGTCCAG(SEQ ID NO:29)或TGACCACGCCAATCGTGTCCAG(SEQ ID NO:14)或CTACCACGCCAATCGTGTCCAG(SEQ ID NO:31)。

本发明属于多肽产生领域。本文报道包含可选择性剪接的核酸的核酸、包含此核酸的细胞、用于分离从本文报道的核酸表达重组(异源)多肽的细胞的方法、以及用于产生重组(异源)多肽的方法。

背景技术

用于产生重组多肽的表达系统为现有技术中公知，并由例如Marino,M.H.,Biopharm.2(1989)18-33；Goeddel,D.V.等,Methods Enzymol.185(1990)3-7；Wurm,F.和Bernard,A.,Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-160描述。对于用于药物应用的多肽和蛋白质的产生，优选利用哺乳动物宿主细胞，如CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、细胞等。优选将编码多肽的核酸包含在核酸例如表达质粒中引入宿主细胞。表达质粒的必需元件是包含复制起点和选择标记的例如用于大肠杆菌(Escherichia coli)的原核质粒繁殖单位、真核选择标记和用于表达一个或多个目的结构基因的一个或多个表达盒，每个表达盒包含启动子、结构基因和转录终止子(包括聚腺苷酸化信号)。为了在哺乳动物细胞中瞬时表达，可以包含哺乳动物复制起点，如SV40Ori或来自EBV的OriP。作为启动子，可以选择组成型或诱导型启动子。为了优化的转录，可以在5’非翻译区包含Kozak序列。对于mRNA加工，尤其是转录终止和前体mRNA剪接，取决于结构基因的组织(外显子-内含子组织)，可以包含mRNA剪接信号以及聚腺苷酸化信号。

基因的表达是作为瞬时表达或永久表达进行。目的多肽可以是包含转运/分泌多肽通过细胞并进入胞外介质所必需的N端延伸(也称为信号序列)的分泌性多肽，或者可以是胞质多肽。

为了大规模产生多肽，必需建立高产细胞系。转染宿主细胞系(如CHO细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、BHK细胞、COS细胞、细胞或HEK细胞)后，通常由于例如从瞬时转染或稳定整合的质粒表达的多肽的广泛差异而获得具有不同特征的多个克隆。为了选择的目的，引入细胞的核酸额外具有选择标记，例如赋予对其他致死物质的抗性的基因。

转染并在适当的选择培养基中生长后，必须分离高产克隆。这耗时并因此昂贵。已发展了若干方法来处理此问题。

这些方法之一是基因扩增。其中用包含用于表达DHFR蛋白的第一表达盒和用于表达异源目的多肽的第二表达盒的质粒/质粒转染二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的细胞。通过使用缺乏甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷的培养基，建立选择生长条件。为了扩增，加入DHFR抑制剂氨甲喋呤(MTX)(Kaufman,R.J.,等,J.Mol.Biol.159(1982)601-621；US 4,656,134)。

备选地，可将报道分子如氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶与希望得到其高产细胞系的异源多肽融合，并用作间接选择标记。选择发生在所加入的外源底物或辅因子的存在下。

用于鉴定高产克隆的另一种方法是选择标记基因和编码异源多肽的结构基因通过内部核糖体进入位点(IRES)连接转录。通过此设计，可以使异源多肽的表达与选择标记的表达相关。