[发明专利]提供用作强效活疫苗的稳定脱水的原生动物的冻干方法

权利要求书

1.一种将来自新孢子虫属的原生动物冻干的方法，其中所述方法包括在冷冻步骤期间，通过用惰性气体或空气加压和减压来控制冰核形成，并且所述方法包括以下步骤：

A.将细胞、新孢子虫属原生动物以及起稳定作用的缓冲液的混合物加入处于约5℃和约1巴的干燥室中，其中所述起稳定作用的缓冲液包含牛血清白蛋白、聚山梨酸酯80、海藻糖、柠檬酸以及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)；

B.将所述腔室的温度降低到-1℃至-15℃，并且保持约5分钟；

C.将所述腔室加压到1.2巴至2巴，并且保持约45分钟，同时将所述腔室的温度维持在-1℃至-15℃；

D.将所述腔室快速减压到约1巴，同时将所述温度保持在-1℃至-15℃；

E.将所述腔室中的所述压力保持在约1巴，将所述温度降低到低至-50℃，并且保持约45分钟；

F.将所述腔室中的所述压力保持在约1巴，将所述温度保持在低至-50℃，再持续约90分钟；

G.将所述腔室中的所述温度保持在低至-50℃，将所述腔室压力降低到约0.1毫巴，并且保持约30分钟；

H.将所述腔室中的所述温度保持在低至-50℃，将所述腔室压力降低到约0.01毫巴，并且保持约60分钟；

I.将所述腔室中的所述压力保持在约0.01毫巴，将所述腔室中的所述温度升高到高达-35℃，并且保持约60分钟；

J.将所述腔室中的所述压力保持在约0.01毫巴，并且将所述温度保持在高达-35℃，并且再保持最多3500分钟；

K.将所述腔室压力降低到约0.005毫巴；将所述温度升高到高达20℃，并且再保持最多360分钟；和

L.将所述腔室中的所述压力保持在约0.005毫巴；并且将所述温度保持在高达20℃，再持续最多900分钟。

2.如权利要求1所述的方法，其中通过用惰性气体加压和减压来控制冰核形成。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述惰性气体是氮气或氩气。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述原生动物是犬新孢子虫。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是制备疫苗中的最终步骤。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是制备疫苗中的中间步骤。

7.如权利要求4所述的方法，其中所述犬新孢子虫是灭活的。

8.如权利要求4所述的方法，其中所述犬新孢子虫是活减毒的。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述犬新孢子虫选自由以下组成的组：Nc-Spain7、NCTS-8、Nc-Nowra、NC-1以及NE1。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述活减毒犬新孢子虫在选自由以下组成的组的蛋白质中具有突变：PTS、MIC-1、MIC-3、IMP-1、GRA1、GRA6、GRA7、AMA1、SAG1、SAG4、GRA2、分拣蛋白样受体、CPS II、RON2、二半乳糖脂抗原；CyP；NcP20以及DHFR。

11.通过如权利要求1所述的方法冻干的犬新孢子虫。

12.一种犬新孢子虫疫苗，所述犬新孢子虫疫苗是通过包括如权利要求1所述的方法的方法制备的。