[发明专利]提供用作强效活疫苗的稳定脱水的原生动物的冻干方法

说明书

公开了一种用于冻干新孢子虫和其他原生动物的改进的起稳定作用的缓冲液。还公开了一种改进的冻干方法，所述方法包括在冷冻步骤期间控制冰核形成。

技术领域

本发明特别涉及冻干犬新孢子虫(Neospora caninum)和保持其活力的方法。本发明还适用于一般用于维持冻干原生动物的活力、免疫原性以及感染性的改进的保存(稳定化)方法。

背景技术

犬新孢子虫是一种专性、细胞内、球虫、原生动物寄生虫。新孢子虫的分类学分类如下：门：顶复门(Apicomplexa)；纲：球虫纲(Coccidia)；目：真球虫目(Eucoccidiorida)；科：肉孢子虫科(Sarcocystidae)；属：新孢子虫属。顶复门基于表型特征含有几个明确定义的群体，包括：球虫(新孢子虫；弓形虫(Toxoplasma)；哈蒙德虫(Hammondia)；隐孢子虫(Cryptosporidium))；簇虫(gregarine)(例如兰克氏原虫(Lankesteria))以及血孢子虫(haemospridian)(例如疟原虫(Plasmodiu)；梨浆虫(piroplasm)(例如泰累尔梨浆虫(Theileria))。

犬新孢子虫能够感染家养和野生的犬科动物以及反刍动物。在犬科动物中，新孢子虫病表现为神经肌肉疾病。在20世纪80年代中期的挪威，狗的犬新孢子虫感染导致了广泛报告的神经肌肉变性病例，这会引起后肢麻痹。在肉牛和奶牛这两者中新孢子虫病是一种经济成本高昂的疾病，并且是牛流产的最常诊断的病因。另一种新孢子虫属物种洪氏新孢子虫(Neospora hughesi)可以感染马，并且与胎儿脑脊髓炎有关(Pusterla等,J.Parasitol.,97:281-5；2011)。

在1988年之前，犬新孢子虫被错误分类为刚地弓形虫(Toxoplama gondii)，这是因为这两者之间具有结构相似性(Dubey,Int J Parasitol.29(10):1485-8；1999)。这两个物种都是组织寄生性球虫并且共有许多共同的生物学和形态特征。然而，甚至是最初将犬新孢子虫识别为一种物种都受到了质疑，这是因为它与海氏哈蒙德虫(Hammondiaheydorni)共有极端相似性(Dubey等,Trends Parasitol.,18:66-9；2002)。虽然这两种生物体之间存在遗传差异，但是它们在物理上是非常相似的；并且海氏哈蒙德虫的卵囊在形态上与犬新孢子虫的卵囊无法区分(McAllister等,J Parasitol.,28:1473-9；1998)。

犬新孢子虫的生命周期包括在犬科动物(终)宿主中的有性复制和在诸如牛的中间宿主中的无性复制。在终宿主的粪便中通过的卵囊可以被牛摄入，之后运动型速殖子被释放，其进而扩散到受感染的牛的整个组织中。速殖子进而发展成缓殖子形式，其在肌肉中形成孢囊。犬科动物通过食用受污染的肉类而受到感染，并且在它们自己的粪便中排出卵囊。卵囊基本上是厚壁孢子，并且它们主要由蛋白质(67％-90％)组成的稳固的壁允许它们在宿主外长时间存活。然而，卵囊壁虽然能抵抗机械和化学损伤，但是易受冷冻和解冻的影响。在某种程度上，这归因于在冷冻和解冻期间发生的刚性卵囊壁的膨胀和收缩的有害影响。然而，速殖子是快速分裂的、运动的并且在它们的膜结构上比卵囊更具流动性。(Belli等,Trends Parasitol.,22(9):416-23,2006；Mai等,Mem.Inst.Oswaldo Cruz,104(2):281-9,2009；Goodswen等,Infection,Genetics,Evolution,13:133-50,2013)。然而，即使是使用速殖子，破坏作用也可能由于细胞内和细胞外冰晶的形成而发生。这必须被减到最低限度和控制，特别是在冻干过程期间。本发明的冻干和稳定化程序一般适用于顶复门原生动物的所有生命周期阶段。