[发明专利]改良的用于产生岩藻糖基化寡糖的方法

权利要求书

1.使用经遗传修饰的原核宿主细胞来产生岩藻糖基化寡糖的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供原核宿主细胞，其已经遗传修饰使得至少(i)果糖-6-磷酸转化酶的活性——其在未经修饰的宿主细胞中具有正常水平——被降低或消除；(ii)在所述宿主细胞中过表达编码从头合成GDP-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因；(iii)在所述宿主细胞中表达编码α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶的外源基因；

-在包含碳源和/或能源的培养基中培养所述经遗传修饰的宿主细胞和/或使其生长，所述碳源和/或能源选自以下的至少一种：丙三醇、琥珀酸盐、苹果酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、乙醇、柠檬酸盐；和

-向所述培养基提供乳糖；

从而产生所述岩藻糖基化寡糖，其可获自在其中培养所述宿主细胞的培养基。

2.权利要求1的方法，其中所述岩藻糖基化寡糖选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖或二岩藻糖基乳糖。

3.权利要求1或2的方法，其中所述宿主细胞选自细菌宿主细胞，优选地选自大肠杆菌菌株(Escherichia coli strain)、乳杆菌属种(Lactobacillus species)或谷氨酸棒状杆菌菌株(Corynebacterium glutamicum strain)。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中通过降低或消除果糖-6-磷酸转化酶的活性，和/或通过提高果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的活性，来增加细胞中的果糖-6-磷酸池，所述果糖-6-磷酸转化酶选自磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、果糖-6-磷酸醛缩酶、转酮醇酶或转醛醇酶。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码从头合成GDP-岩藻糖的酶的基因是磷酸甘露糖变位酶编码基因，优选manB，甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶编码基因，优选manC，GDP-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因，优选gmd，和GDP-L-岩藻糖合酶编码基因，优选wcaG。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码至少一种岩藻糖基转移酶的基因显示出α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶活性。

7.权利要求6的方法，其中所述编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因选自大肠杆菌O126的wbgL或来自幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的fucT2。

8.权利要求6的方法，其中所述编码α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因选自物种嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、幽门螺旋杆菌或肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus)的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主细胞经进一步遗传修饰以表达编码使得能够或促使将所需岩藻糖基化寡糖输出到培养基中的蛋白的基因。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中用于输入乳糖的内源或外源通透酶被过表达。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主细胞中被修饰的基因或用于修饰所述宿主细胞的基因是内源基因或外源基因。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主细胞中被修饰的基因或用于修饰所述宿主细胞的基因中的至少一种基因在内源或外源诱导时被过表达或以组成型方式被过表达。

13.权利要求9的方法，其中编码使得能够或促使输出所需岩藻糖基化寡糖的蛋白的基因是糖外排转运蛋白，优选地选自yberc0001_9420和SetA。