[发明专利]改良的用于产生岩藻糖基化寡糖的方法

说明书

本发明涉及通过使用在葡萄糖异生底物上培养的重组原核宿主细胞来产生岩藻糖基化寡糖的方法，以及涉及所述宿主细胞及其用途。所述宿主细胞经过遗传修饰，使果糖‑6‑磷酸转化酶的活性被消除或降低，并且外源转运蛋白促进了所产生的岩藻糖基化寡糖转运通过细胞膜。

技术领域

本发明涉及通过使用经遗传修饰的原核宿主细胞来产生岩藻糖基化寡糖的方法，以及涉及该方法中使用的宿主细胞及其用于产生高效价的岩藻糖基化寡糖的用途。

背景技术

人乳是碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和微量元素的复杂混合物。迄今为止最占优势的级分是碳水合物，其可进一步分成乳糖和更复杂的寡糖(人乳寡糖，HMO)。然而乳糖被用作能源，复杂寡糖却不被婴儿代谢。复杂寡糖的级分占总碳水化合物级分的最高达20％，并且由200多种不同的寡糖组成。这些复杂寡糖的存在和浓度是人类所特有的，因此无法在其他哺乳动物的乳中大量发现。

迄今为止已鉴定了约200种结构各异的HMO，并且报道了许多有益特性。HMO不被母乳喂养的婴儿消化，但却是肠中双歧杆菌属(Bifidobacteria)、乳杆菌属(Lactobacillus)和拟杆菌属(Bacteroides)的有益细菌的有价值的碳源和能源，使它们在肠道中占据优势并在竞争中战胜病原体，因此预防肠道上皮感染。然而，HMO还直接结合至致病性细菌、原生动物和病毒，通过模拟聚糖细胞表面受体来阻断病原体-宿主相互作用，从而保护母乳喂养儿童免于传染病。

最重要的寡糖是2’-岩藻糖基乳糖。存在于人乳中的其他重要HMO是3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖和乳-N-岩藻戊糖。除这些中性寡糖以外，还可在人乳中发现酸性HMO，例如3’-唾液酰乳糖、6’-唾液酰乳糖以及唾液酰乳-N-四糖a、b和c，或唾液酰乳-N-岩藻戊糖II等。这些结构与上皮细胞表面糖缀合物的表位(Lewis组织血型抗原)是近缘的，HMO与上皮表位的结构同源性说明了针对细菌病原体的保护特性。

由于它们的有益特性，将HMO作为组分包含于婴儿配方物和其他食品中是有利的，这使得大量(最高达数吨级别)生产HMO成为必需的。

由于受限的供应和难以获得各个人乳寡糖的纯级分，开发了获得这些复杂分子中的一些的化学途径。然而，被证实在商业上不可持续的化学和生物催化方法，且另外，尤其是人乳寡糖的化学合成途径包括若干有毒的化学品，这带来污染最终产物的风险。

由于人乳寡糖的化学合成中涉及的挑战，开发了若干酶促方法和发酵方法。今天，对于若干HMO如2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻戊糖I、乳-N-二岩藻己糖II、3’-唾液酰乳糖和6’-唾液酰乳糖而言，已开发了发酵方法，这些方法主要使用经遗传工程化的细菌菌株如重组大肠杆菌(Escherichia coli)。

然而，即使是目前可获得的基于细菌发酵的最有效方法，也无法或几乎无法实现在发酵液中大于20g/L的HMO效价。工业级方法必须通常超过50g/L的效价，尽管100g/L更为理想。

因此，本发明的目的是提供改进的发酵方法，通过这种方法使得可以实现效价超过100g/L以上的岩藻糖基化寡糖(特别是2’-岩藻糖基乳糖)的生物合成。

发明内容

该目的和其他目的是通过使用经遗传修饰的原核宿主细胞来产生岩藻糖基化寡糖的方法得以解决，所述方法包括以下步骤：

-提供宿主细胞，其已经遗传修饰，使得至少(i)果糖-6-磷酸转化酶的活性——其在未经修饰的宿主细胞中具有正常水平——被降低或消除；(ii)在所述宿主细胞中过表达编码从头合成GDP-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因；(iii)在所述宿主细胞中表达(优选地过表达)编码岩藻糖基转移酶(优选α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶)的外源基因；