[发明专利]制备双标签DNA库用于亚硫酸盐转化定序的方法

说明书

本发明公开多种使用亚硫酸氢盐转化定序制备双标签核酸库用于甲基化图谱的方法。在各种实施例中，所述方法使用两步骤标签程序来标记具有独特分子标识物(UMIs)的亚硫酸氢盐处理的DNA。

相关申请的交叉引用

本申请主张于2016年8月10日提交的美国专利临时申请案申请号为62/373,261的优先权以及于2016年9月21日提交的国专利临时申请案申请号为62/397,650的优先权，两者公开内容均通过引用并入本文作为参考。

背景技术

DNA甲基化在调节基因表达中起重要作用。异常的DNA甲基化与许多疾病过程有关，包括癌症。使用亚硫酸氢盐转化定序的DNA甲基化图谱分析逐渐被认为是用于检测和诊断癌症的有价值的诊断工具。例如，甲基化差异区域及/或等位基因特异性甲基化的特定模式可以用作使用循环游离DNA的非侵入性诊断的分子标记。然而，在定序库制备及/或测序期间引入的扩增及/或定序假象(错误)可能使DNA甲基化分析的结果产生偏差。需要制备用于甲基化分析的亚硫酸氢盐转化定序的DNA库的新方法。

发明内容

本文公开了使用亚硫酸氢盐或酶促转化定序制备用于甲基化图谱的双标签核酸库的方法。在各种实施例中，所述方法使用两步骤标签程序来标记亚硫酸氢盐处理的或酶促转化的具有独特分子识别物(UMIs)的DNA(其中未甲基化的胞嘧啶在转化的DNA中转化为尿嘧啶)，其中附加第一独特分子识别物至使用一单股DNA(ssDNA)接合反应转化的DNA，并在随后的程序步骤(例如双股接合步骤)中加入第二独特分子识别物。独特分子识别物用于鉴定个别DNA分子并减少或基本上消除定序及/或扩增诱导的假象(基于多个序列片段间的共同性使用相同的独特分子识别物)，从而提高DNA甲基化分析的准确性。

在本发明的一些实施例中，提供一种测定一个体的一甲基化图谱的方法，所述方法包括步骤：从所述个体获得一生物样品；在所述生物样品的核酸分子中将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，以产生亚硫酸氢盐转化的核酸分子；确定所述转化的核酸分子的核酸序列；以及将所述转化的核酸分子的所述核酸序列与一参考核酸序列进行比较，以确定所述个体的所述甲基化图谱。在某些实施例中，所述个体是人。在某些实施例中，所述生物样品包括血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓液或淋巴液。在某些实施例中，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤更包括：与亚硫酸氢盐离子一起培养。在某些实施例中，所述核酸分子为DNA。在某些实施例中，所述DNA为游离DNA。在某些实施例中，所述游离DNA来自线性染色体。在某些实施例中，所述线性染色体是体染色体。在某些实施例中，所述方法还包括：将一核酸连接物接合到所述转化的核酸上。在某些实施例中，所述核酸连接物包含一独特分子识别物。在某些实施例中，所述核酸连接物包含一通用引发位点。在某些实施例中，所述核酸连接物为单股。在某些实施例中，所述核酸连接物是部分单股和部分双股的。在某些实施例中，接合所述核酸连接物是在单股核酸上进行的。在某些实施例中，所述核酸连接物附着于一固体支撑物。在某些实施例中，所述固体支撑物为一颗粒。在某些实施例中，所述颗粒是不耐热性的。在某些实施例中，所述方法还包括：对所述转化的核酸分子、未转化的核酸分子或两者进行引子延伸。在某些实施例中，所述方法还包括：将一核酸连接物连接到所述转化的核酸分子的一第二末端。在某些实施例中，将所述核酸连接物连接到所述转化的核酸分子的第二末端的步骤是在所述转化的核酸分子的5'端和最接近所述转化的核酸分子的5'端的第三连接物的3'端之间产生一间隙。在某些实施例中，所述方法还包括：在确定所述核酸序列之前扩增所述转化的核酸分子。在某些实施例中，所述扩增包括聚合酶连锁反应。在某些实施例中，所述扩增使得所述转化的核酸分子、所述未转化的核酸分子或两者增加了定序连接物。在某些实施例中，所述确定核酸序列的步骤包括次世代定序。在某些实施例中，确定核酸序列的步骤包括通过合成、焦磷酸定序或离子半导体定序进行定序。在某些实施例中，确定所述核酸序列的步骤包括定序到至少10,000x的定序深度。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于筛选或诊断自身免疫疾病。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于筛选或诊断癌症。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于筛查或诊断器官损伤、器官疾病或器官衰竭。在某些实施例中，所述甲基化图谱用于移植排斥。在某些实施例中，所述方法还包括将甲基化图谱与任何家族史、临床数据、基因组定序数据、蛋白质组学数据或微生物组数据组合使用以筛选或诊断自身免疫疾病、癌症、器官衰竭或器官移植排斥。