[发明专利]从头组装条码化的基因组DNA片段的方法

说明书

本公开提供了用于使用条码化的片段从头组装基因组DNA的方法。

相关申请数据

本申请要求于2016年8月10日提交的美国临时申请号62/373,057号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。

政府权益的声明

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)的5DP1CA186693下于政府资助下完成。政府对本发明享有某些权利。

背景技术

发明领域

本发明的实施方式通常涉及用于由单个细胞从头组装基因组核酸(如DNA)的方法和组合物。

背景技术

基因组从头组装是在没有参照序列的帮助下将单个短测序读数组装成较长序列的过程。当前，大多数的高通量测序产生仅几百个碱基对的序列长度。然后，通过确定这些片段在何处重叠，将这些短片段重建在一起。然而，在复杂的生物体，例如人类的基因组中存在许多重复序列。许多这些重复区域长于DNA测序仪的读数长度，这使得组装没有缺口的全基因组十分困难。

在细胞间变异和种群异质性起关键作用的研究中，如肿瘤生长、干细胞重编程、胚胎发育等，进行单个细胞基因组测序的能力非常重要。当进行测序的细胞样品非常珍贵或稀有或以微量存在时，单个细胞基因组测序也同样非常重要。准确的单个细胞基因组测序的重要之处在于基因组DNA(可以是处于微量的)的初始扩增。

扩增和测序后的基因组从头组装是用于全基因组测序的许多方法的一个重要方面。全基因组扩增方法包括多重置换扩增(MDA)，其是在测序和其它分析之前在采用来自单个细胞的基因组DNA的领域的常用方法。在该方法中，随机引物退火后，利用具有强链置换活性的DNA聚合酶进行延伸。来自单个细胞的原始基因组DNA以级联样的形式指数地扩增，以形成超支化DNA结构。扩增来自单个细胞的基因组DNA的其它方法述于Zong,C.,Lu,S.,Chapman,A.R.,和Xie,X.S.(2012),单个人细胞的单核苷酸和拷贝数变异的基因组范围检测(Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of asingle human cell),Science 338,1622-1626，其中描述了多重退火和基于环型的扩增循环(MALBAC)。本领域所知的另一方法是简并寡核苷酸引物PCR或DOP-PCR。用于单个细胞基因组DNA的若干其他方法包括：Cheung,V.G.和S.F.Nelson,使用简并寡核苷酸的全基因组扩增允许成百上千个基因型以少于一纳克的基因组DNA进行(Whole genomeamplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds ofgenotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA),Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,1996.93(25):14676-9页；Telenius,H.,等,简并寡核苷酸引发的PCR：通过单个简并引物的常规扩增(Degenerate oligonucleotide-primed PCR:general amplificationof target DNA by a single degenerate primer),Genomics,1992.13(3):718-25页；Zhang,L.,等,单个细胞的全基因组扩增：对基因分析的启示(Whole genomeamplification from a single cell:implications for genetic analysis).Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,1992,89(13):5847-51页；Lao,K.,N.L.Xu,和N.A.Straus,使用单个引物的PCR的全基因组扩增(Whole genome amplification using single-primer PCR),Biotechnology Journal,2008,3(3):378-82页；Dean,F.B.,等,使用多重置换扩增的完整人基因组扩增(Comprehensive human genome amplification using multipledisplacement amplification),Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America,2002.99(8):5261-6页；Lage,J.M.,等,使用超支化链置换扩增和列阵-CGH对小DNA样品中基因变异的全基因组分析(Whole genome analysisof genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched stranddisplacement amplification and array-CGH),Genome Research,2003,13(2):294-307页；Spits,C.,等,单个细胞全基因组置换扩增的优化和评价(Optimization andevaluation of single-cell whole-genome multiple displacement amplification),Human Mutation,2006,27(5):496-503页；Gole,J.,等,使用纳米微微管进行单个细胞大规模平行聚合酶克隆和基因组测序(Massively parallel polymerase cloning and genomesequencing of single cells using nanoliter microwells),Nature Biotechnology,2013.31(12):1126-32页；Jiang,Z.,等,使用多重置换扩增的单个精子的基因组扩增(Genome amplification of single sperm using multiple displacementamplification),Nucleic Acids Research,2005,33(10):e91页；Wang,J.,等,静止细胞中重组活性和新生突变比例的基因组范围单个细胞分析(Genome-wide Single-CellAnalysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in HumanSperm),Cell,2012.150(2):402-12页；Ni,X.,肺癌患者单循环肿瘤细胞中可再生拷贝数变异模式(Reproducible copy number variation patterns among single circulatingtumor cells of lung cancer patients),PNAS,2013,110,21082-21088；Navin,N.,通过细胞测序推测肿瘤进化(Tumor evolution inferred by single cell sequencing),Nature,2011,472(7341):90-94；Evrony,G.D.,等,人大脑中11个反转录转座和体细胞突变的单个神经元测序分析(Single-neuron sequencing analysis of l1retrotransposition and somatic mutation in the human brain),Cell,2012.151(3):483-96页；和McLean,J.S.,等,使用高通量单个细胞基因组学平台从医院槽中的生物膜中回收牙龈卟啉单胞菌病原体的基因组(Genome of the pathogen Porphyromonasgingivalis recovered from a biofilm in a hospital sink using a high-throughput single-cell genomics platform),Genome Research,2013.23(5):867-77页。涉及全基因组扩增方面的方法报道于WO 2012/166425，US 7,718,403，US 2003/0108870和US 7,402,386。