[发明专利]使用猝灭剂的基于光学的纳米孔测序

权利要求书

1.一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括：

使多核苷酸易位通过纳米孔，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记，并且其中所述纳米孔将核苷酸限制为依次移动通过检测区；

激发所述荧光标记物；

使用非荧光猝灭剂猝灭来自所述检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；

当所述荧光标记物通过所述检测区时，检测从所述荧光标记物发射的荧光信号；以及

根据检测到的荧光信号确定核苷酸的序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述非荧光猝灭剂包含具有附接至其的至少一个猝灭部分的寡核苷酸，并且其中所述纳米孔仅易位单链核酸，使得在易位期间每当所述非荧光猝灭剂与所述多核苷酸结合时，所述非荧光猝灭剂被从所述多核苷酸移除。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述纳米孔具有出口，并且所述检测区包括邻近所述出口并且包围所述出口的体积。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述多核苷酸具有易位速度，并且所述检测区的所述体积由所述多核苷酸的易位速度和所述出口处所述非荧光猝灭剂的浓度确定。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述非荧光猝灭剂包括双链的嵌入剂，并且其中所述纳米孔仅易位单链核酸，使得在易位期间每当所述非荧光猝灭剂嵌入所述多核苷酸时，所述非荧光猝灭剂被从所述多核苷酸移除。

6.一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括：

使多核苷酸易位通过具有出口的纳米孔，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记，并且其中所述纳米孔将所述核苷酸限制为依次移动通过在所述纳米孔出口处的检测区；

激发所述荧光标记物；

使用与所述多核苷酸结合的非荧光猝灭剂猝灭来自所述检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；

当所述荧光标记物通过所述检测区时，检测从所述荧光标记物发射的荧光信号；以及

根据检测到的荧光信号确定核苷酸的序列。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述非荧光猝灭剂包含具有附接至其的至少一个猝灭部分的寡核苷酸，并且其中所述纳米孔仅易位单链核酸，使得在易位期间每当所述非荧光猝灭剂与所述多核苷酸结合时，所述非荧光猝灭剂被从所述多核苷酸移除。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述检测区包括邻近所述出口并包围所述出口的体积。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述多核苷酸具有易位速度，并且所述检测区的所述体积由所述多核苷酸的所述易位速度和所述出口处所述非荧光猝灭剂的浓度确定。

10.一种确定多核苷酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)提供一种纳米孔阵列，所述纳米孔阵列包含具有第一侧、第二侧和从其穿过的多于一个纳米孔的固相膜，所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每个纳米孔提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通，并且每个纳米孔具有通向所述第二室的出口并且被定制尺寸以使单链核酸通过而双链核酸无法通过，并且每个纳米孔将易位的多核苷酸的核苷酸限制为依次移动通过在其出口处的检测区；

(b)使多核苷酸从所述第一室通过所述纳米孔易位至所述第二室，每个多核苷酸具有附接至其核苷酸的一个或更多个荧光标记物，使得不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记；

(c)用激发光束照射所述荧光标记物；

(d)用与所述多核苷酸结合的非荧光猝灭剂猝灭来自所述检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；

(e)检测来自所述检测区内的荧光标记物的荧光信号；

(f)根据检测到的荧光信号确定所述多核苷酸的核苷酸序列。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述固相膜包含不透明层，所述不透明层基本上阻挡所述激发光束的透射，并且其中所述照明和检测的步骤包括落射照明系统。