[发明专利]使用猝灭剂的基于光学的纳米孔测序

说明书

本发明涉及用于使用纳米孔的基于光学的多核苷酸分析的方法和组合物，其中猝灭剂用于减少或消除由检测区外的多核苷酸标记物产生的杂散光学信号。在一些实施方案中，本发明可以通过下步骤来实施：使多核苷酸易位通过纳米孔，其中多核苷酸的不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记，并且其中所述纳米孔将核苷酸限制为依次移动通过检测区；激发所述荧光标记物；使用一种或更多种非荧光猝灭剂猝灭来自检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；当荧光标记物通过检测区时，检测从荧光标记物发射的荧光信号；以及根据检测到的荧光信号确定核苷酸的序列。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年8月19日提交的美国临时专利申请第62/377,409号的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。

发明背景

核苷酸的光学检测已经作为对于纳米孔测序领域中一些技术困难诸如，例如同时从大规模纳米孔阵列收集独立信号的困难的可能解决方案被提出。然而，实施光学方法存在许多挑战，特别是相对于明显的光学噪声背景测量来自易位的多核苷酸上的单分子标记物的光学信号的困难。来自单分子的荧光信号的测量已经在多种情况下进行，例如Lackowitz，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第三版(Springer,2006)；Moerner等人，Review of Scientific Instruments,74(8):3597-3619(2003)；Michalet等人Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,32:161-182(2003)；包括与基于流(flow-based)的高速DNA测序相关的那些情况，例如Jett等人，J.Biomol.Struct.Dyn.,7(2):301-309(1989)。然而，基于光学的纳米孔测序呈现新的挑战，因为它需要测量来自快速通过纳米级检测区的完整多核苷酸上的标记物的连续光学信号。特别地，检测区外的光学标记物可能对收集的信号中的噪声有显著贡献。

鉴于以上情况，如果方法可用于消除或减少来自检测区外的标记物的光学噪声，基于光学的纳米孔测序将会得到改进。

发明概述

本发明涉及用于使用纳米孔的基于光学的多核苷酸分析的方法和组合物。在一个方面，本发明涉及猝灭剂减少或消除由检测区外的多核苷酸标记物产生的杂散光学信号(spurious optical signals)的用途。

在一个方面，本发明涉及一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤:(a)使多核苷酸易位通过纳米孔，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记，并且其中纳米孔将核苷酸限制为依次移动通过检测区；(b)激发所述荧光标记物；(c)使用非荧光猝灭剂猝灭来自检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；(d)当荧光标记物通过检测区时，检测从所述荧光标记物发射的荧光信号；以及(e)根据检测到的荧光信号确定核苷酸的序列。

在另一个方面，本发明涉及一种确定多核苷酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供纳米孔阵列，所述纳米孔阵序列包含具有第一侧、第二侧和从其穿过的多于一个(a plurality of)纳米孔的固相膜，所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每个纳米孔提供第一室和第二室之间的流体连通，并且每个纳米孔具有通向第二室的出口并且被定制尺寸以使单链核酸通过而双链核酸无法通过，并且每个纳米孔将易位的多核苷酸的核苷酸限制为依次移动通过在其出口处的检测区；(b)使多核苷酸从第一室通过纳米孔易位至第二室，每个多核苷酸具有被附接至其核苷酸的一个或更多个荧光标记物，使得不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记；(c)用激发光束照射荧光标记物；(d)用与多核苷酸结合的非荧光猝灭剂猝灭来自检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；(e)检测来自检测区内的荧光标记物的荧光信号；(f)根据检测到的荧光信号确定多核苷酸的核苷酸序列。