[发明专利]使用单细胞分析进行疾病诊断的组合物和方法

说明书

本发明的特定实施方案涉及通过记录和解释由分离的活细胞的独特细胞呼吸和渗透性属性所产生的时间依赖性信号来评估和识别细胞。

优先权请求

本申请要求于2017年3月22日提交的美国申请第15/466377号和2016年10月12日提交的美国申请第62/407311号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开一般涉及细胞生物学，更具体地涉及用于识别致病细胞，以及快速且灵敏地表征致病细胞对用于治疗它们的药物的响应的组合物和方法。

背景技术

在各种情况下，发现致病细胞(DCC)的量低于常规分析技术的检出限。因此，根据应用，用于识别DCC和表征它们对治疗的响应的方法通常需要靶细胞的增加和/或靶细胞的分子成分和/或产物的靶标依赖性扩增。

由于与其他技术相比的高灵敏度，核酸扩增(例如，基于PCR)测试(NAT)已成为快速病原体识别的优选方法。基于培养的方法是目前用于抗微生物敏感性试验的优选方法，因为该方法评估微生物表型，从而提供高临床有效性。

NAT需要复杂的样品工作流步骤，其通常包括细胞裂解以及随后的还要从样品中去除PCR抑制剂的核酸浓缩步骤。细胞裂解导致了对核酸提取效率的要求的不对称性。例如，与革兰氏阴性细菌相比，分枝杆菌和真菌具有非常厚的细胞壁，因此更难裂解，通常需要机械裂解步骤以有效地破坏它们的细胞壁。因此，利用简单化学裂解方法的NAT通常缺乏对这些更难以处理的病原体的敏感性。此外，细胞裂解试剂极大程度地抑制PCR反应，因为它们被设计为有效地使蛋白质变性且PCR利用蛋白质进行扩增反应。因此，细胞裂解需要高效洗涤步骤以从提取的核酸中去除裂解试剂。此外，NAT需要昂贵的分析开发方法，因为它们依赖于必须针对每种靶标专门设计的病原体特异性报道分子(引物和探针)。因此，每个NAT必定包括昂贵的分子研发过程，其涉及引物/探针设计和每个靶标的筛选。

此外，如果NAT测定包括多于一种靶标(多重测定)，则需要多于一种报道分子种类(引物对)，那么不同的靶标和/或报道分子种类可以彼此非特异性相互作用，从而在报道分子非特异性地针对其他试剂扩增时导致假阳性，或在靶标扩增反应被与另一种类的非特异性相互作用抑制时导致假阴性。因此，这限制了在单个NAT内可以识别的靶标数量。这与耐药性问题特别相关，因为在革兰氏阴性细菌和分枝杆菌的情况下，存在许多指示耐药性的突变(每一个突变是一个靶标)。NAT只能在一次测试中检测这些突变的一小部分。此外，存在于生物体基因型中的基因可能并不总是对表型有贡献。因此，基因型信息通常描绘了病原体表型反应的不准确或不完整的图像。例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)通常不表达赋予耐药性的mecA基因。因此，当涉及引起感染的病原体是否对特定药物敏感的重要临床确定时，NAT具有低的临床有效性。

包含两个或多于两个靶标的NAT(多重)无法准确并精确地同时量化这些靶标。这是因为上述报道分子种类之间相同的非特异性相互作用也引起PCR信号输出的变化，并且定量PCR依赖于可重复的反应结果，以便将产生的扩增曲线与初始靶标浓度相关联。这是一个重要的限制，因为它阻止使用多重NAT来诊断来自未灭菌流体的感染，因为人类常常被可能引起感染的相同病原体定殖。因此，在未灭菌流体中，临床样品中存在的病原体的数量(病原体载量)决定细菌种类是引起感染还是“平静地”在流体中定殖。例如，为了明确诊断来自支气管镜检样品(例如支气管肺泡灌洗(BAL))的肺炎感染源，样品中存在的任何细菌的病原体载量必须超过10³CFU/mL才能被认为是感染源。类似地，对于尿液样品，阈值为10⁵CFU/mL。

此外，当感染病原体之一是挑剔的生物体(具有复杂营养需求并且通常仅在特定条件下生长的生物体)而另一种病原体不是时，定量培养方法遇到识别多微生物感染的问题。非挑剔生物体经常会在培养板上淹没挑剔生物体，并隐藏该挑剔生物体在样品中的存在。这是特别大的问题，因为许多耐药性微生物是挑剔的非发酵棒状微生物(革兰氏阴性)。