[发明专利]修饰的糖蛋白和糖肽的表达

说明书

本发明提供了含有引起至少一种甘露糖基转移酶的表达或功能改变的修饰的重组细胞。作为该修饰的结果，细胞产生具有简化或人源化的N‑连接聚糖谱的糖蛋白或糖肽。与不具有该修饰的细胞产生的糖蛋白或糖肽相比，该糖蛋白或糖肽可以具有低至少25％的高甘露糖结构。在一些实施方案中，所述修饰是编码甘露糖基转移酶的基因的缺失、敲除或破坏，所述编码甘露糖基转移酶的基因可以在Alg3基因中。因此，所产生的蛋白质避免了与来自具有外源或植物样糖基化模式的物种的糖蛋白的治疗用途相关的许多问题。本发明还提供了糖蛋白或糖肽的组合物及其制备方法。

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2016年11月1日提交的美国序列号62/416,086的优先权权益，其全部内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及具有人源化或简化的N-聚糖模式的蛋白质和肽的产生，宿主细胞，产生糖蛋白和糖肽的方法，以及可用于该方法的表达盒和其他工具。

背景技术

微生物表达系统对有用蛋白质的生产具有许多优点。虽然某些微生物系统可用于生产简单的蛋白质，但是需要改进这些微生物系统以有效生产更复杂的蛋白质。微生物细胞特异性生产力的提高需要复杂的工程，以及对潜在微生物代谢的实质性理解和重新布线(rewiring)。理想的菌株是遗传稳定的，具有高的特异性和体积生产力，不形成副产物，并使用明确的培养基。这些特性将允许以有限数量的步骤进行下游处理。

网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)是强大可发酵的真核微藻。这些异养微生物因其消耗糖的工业能力和储存大量细胞油作为甘油三酯而被公认；商业上最重要的是二十二碳六烯酸(DHA)，一种ω-3多不饱和脂肪酸(PUT A)，是鱼油的主要成分。这些生物产生的油可用于人类和动物营养补充剂，以及用于食品强化应用。这些甘油三酸酯油可以使用廉价的培养基在培养物中生产。

由于这些期望的品质，具有能够产生多种蛋白质或治疗性蛋白质(包括治疗性蛋白质和功能性抗体)的重组网粘菌纲细胞将是有利的。

许多治疗性蛋白质需要N-连接的糖基化才能最佳地发挥作用。合成N-连接聚糖的人类途径不同于其他哺乳动物、无脊椎动物、植物、昆虫和低等真核生物(例如真菌酵母)。当试图在异源宿主中表达人蛋白质时出现了一个问题，即感兴趣的蛋白质不含有人N-连接的聚糖，而是用异源宿主内源的N-连接聚糖修饰。这可能导致无数问题，包括过敏原、活性较低、无活性、溶解性较差、不溶、不稳定、不能与生物靶标正确相互作用的蛋白质。因此，具有能够产生含有人类糖基化模式或简化糖基化模式的蛋白质的异源宿主系统将是非常有用的，所述简化糖基化模式可以容易地转化为人类模式。

发明内容

本发明提供了重组宿主细胞，其在一个或多个编码甘露糖基转移酶的基因中含有遗传修饰。作为修饰的结果，细胞产生糖蛋白或糖肽，其具有人源化或类人的或被简化的N-连接聚糖谱(glycan profile)。在一些实施方案中，与不具有修饰的细胞产生的糖蛋白或糖肽相比，该糖蛋白或糖肽的高甘露糖N-聚糖结构低至少25％。遗传修饰可以是缺失、敲除或破坏，其可以在Alg3基因中，宿主细胞可以是网粘菌纲细胞。因此，其产生的蛋白质避免了与使用具有非人物种糖基化模式的糖蛋白或糖肽相关的许多问题。本发明还提供了糖蛋白或糖肽的组合物，制备它们的方法，以及可用于该方法的核酸构建体。