[发明专利]modRNA的细胞特异性表达

说明书

本文公开了用于细胞特异性转录(表达)感兴趣蛋白的表达调控系统，例如在成年或新生儿心肌细胞或产生胰岛素的β细胞中再激活增殖的细胞周期诱导物。该表达调控系统包含编码特异性结合靶细胞miR的microRNA识别元件和翻译抑制蛋白的第一核酸；和包含结合翻译抑制蛋白的抑制蛋白相互作用基序和编码感兴趣蛋白的基因的第二核酸。当感兴趣细胞被该系统的第一和第二核酸共转染时，感兴趣蛋白以细胞特异性方式表达。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年9月16日提交的美国临时申请号62/395,701的优先权，其内容通过引用并入本申请中。

序列表

本申请包含2016年9月7日创建的序列表；该文件以ASCII格式指定为3710029P_SequenceListing_ST25.txt，大小为11,278字节。该文件通过引用整体并入本申请中。

技术领域

本公开内容一般地涉及使用基于细胞特异性miR推翻基因表达抑制的的细胞特异性转录调控系统在体外、离体和体内细胞特异性表达治疗性蛋白的平台。

背景技术

化学修饰的信使RNA(modRNA)是一种治疗策略，其使细胞机器能够在不修饰基因组的情况下产生感兴趣基因。因此，modRNA避免了常规基因治疗中出现的几个问题，包括缺乏基因组整合、表达持久性、免疫原性、可扩展性和生产中的困难、需要终身监测肿瘤发生和其他不良临床结果、以及载体逃逸到体循环以及体内其他部位的长期表达的可能性。

modRNA作为疾病治疗具有相当大的潜力。例如，通过modRNA传递细胞周期诱导物将触发糖尿病个体中β细胞的生长或恢复心肌梗塞或心力衰竭后心肌细胞的增殖。通过传递编码神经生长因子的基因的能力可以减轻糖尿病性神经病变。此外，随着基因组编辑技术的出现，如果以瞬时和细胞特异性方式传递，则CRISPR/Cas9或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)转染将更安全。

然而，可获得的modRNA的转染试剂均未提供高水平的基因表达和靶向任何感兴趣细胞的能力。例如，常见的体内转染试剂是体内(SA,Illkirch,France)，其是基于聚合物的试剂，与modRNA复合以形成纳米颗粒。然而，体内-jetPEI在体内主要靶向肺组织，与裸modRNA相比显著降低转染效力。

因此，需要的是基于modRNA的基因传递系统，其在感兴趣的细胞中排他性地实现高水平的基因表达。

发明内容

本公开提供了用于细胞特异性转录的表达调控平台，其基于开发阻遏RNA结合蛋白/k-基序相互作用偶联细胞特异性miR推翻阻遏功能，以细胞特异性方式控制传递的modRNA的表达。RNA结合蛋白如古细菌蛋白L7Ae及其真核同源物如L30e识别特殊的RNA基序，扭结-转角(本文指k-转角或k-基序)。通过将k-基序并入编码感兴趣基因(GOI)的第一构建体中并且在编码RNA结合蛋白的第二构建体中包含针对细胞特异性miR的识别元件，当这两种构建体共转染到合适的细胞类型中时GOI表达的抑制被推翻。该平台包含修饰的mRNA。

因此，本公开涉及用于实现感兴趣基因(GOI)的modRNA的细胞特异性表达的方法，仅期望该感兴趣基因(GOI)在感兴趣细胞中表达。在一个方面，本公开描述了用于细胞特异性转录的表达调控系统，该系统包含编码(1)细胞特异性microRNA(miR)识别元件和(2)翻译抑制蛋白的第一核酸；和编码(1)抑制蛋白相互作用基序，例如其5'UTR下游结合翻译抑制蛋白的K-基序，和(2)编码感兴趣蛋白的基因的第二核酸。核酸是modRNA。

通过交换miR识别元件，可以调节细胞特异性，使系统适应其他细胞类型。