[发明专利]用于增强的安全性的自限制性Cas9回路（SLiCES）质粒及其慢病毒系统

权利要求书

1.一种用于增强的安全性的CRISPR/CAS9自限制性Cas9回路(SLiCES)质粒，其包含：

用于Cas9分子的表达盒；

编码靶向所述Cas9分子的sgRNA(抗Cas9sgRNA)的核苷酸序列；和

编码靶向选择的基因组基因座的sgRNA(靶sgRNA)的核苷酸序列；

其中

至少一个内含子存在于用于所述Cas9分子的所述表达盒的开放阅读框(ORF)中以形成分成两个或更多个外显子的表达盒，和/或至少一个内含子存在于编码所述抗Cas9 sgRNA的成熟转录物的核苷酸序列中，所述内含子在编码分成两个或更多个外显子的表达盒的转录的序列中；和/或

用于所述Cas9分子的所述表达盒和/或编码抗cas9sgRNA的所述序列是在包含诱导型启动子的序列之后。

2.根据权利要求1所述的质粒，其中所述抗Cas9sgRNA由17-23个核苷酸的序列编码，优选以G开始。

3.根据权利要求2所述的质粒，其中抗Cas9sgRNA编码序列是与选自SEQIDN.1-6的序列具有至少60％同源性的序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的质粒，其中用于Cas9分子的所述表达盒和/或编码抗Cas9sgRNA的所述核苷酸序列包含至少一个内含子；并且

用于所述Cas9分子的所述表达盒和/或编码抗cas9sgRNA的所述序列是在包含诱导型启动子的序列之后。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的质粒，其中用于所述Cas9分子的所述表达盒和编码抗cas9sgRNA的所述序列两者是在包含诱导型启动子的序列之后。

6.一种遗传修饰的微生物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的质粒。

7.一种细胞，其被根据权利要求1-5中任一项所述的质粒转染。

8.一种病毒或人工递送系统，其包括根据权利要求1-5中任一项所述的质粒。

9.根据权利要求1-5中任一项所述的质粒或根据权利要求8所述的病毒或人工系统，其用作药物。

10.根据权利要求9所述使用的质粒或病毒或人工系统，其用于治疗单基因疾病、高胆固醇、抗胰蛋白酶缺陷、癌症、糖尿病、感染性细菌和病毒性疾病。

11.根据权利要求1-5中任一项所述的质粒或根据权利要求8所述的病毒或人工系统在基因组工程、细胞工程、蛋白质表达或生物技术中的体外用途。

12.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的质粒或根据权利要求8所述的病毒或人工系统和至少另外的药学上可接受成分。

13.一种用于制备根据权利要求8所述的病毒系统的方法，所述方法包括

用根据权利要求1-5中任一项所述的质粒转化细菌，所述细菌其中通过所述内含子的存在或通过对所述诱导型启动子特异的阻遏物的表达或通过倾向于阻止Cas9和/或sgRNA表达的另外的系统来阻止Cas9和/或sgRNA的表达；和/或

用根据权利要求1-5中任一项所述的质粒转染细胞，所述细胞表达对所述诱导型启动子特异的阻遏物或所述细胞包含用于调节Cas9和/或抗Cas9gRNA表达的另外的系统。

14.一种用于阻止在细菌中的毒性转录物的成熟表达的方法，所述方法包括在编码所述毒性转录物的核苷酸序列中导入至少一个内含子；所述内含子在编码分成两个或更多个外显子的表达盒的转录的序列中。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述毒性转录物起到用于核酸酶的指导RNA或其一部分的作用。