[发明专利]用于增强的安全性的自限制性Cas9回路（SLiCES）质粒及其慢病毒系统

说明书

本发明描述了用于增强的安全性的自限制性Cas9回路(SLiCES)，其由用于化脓性链球菌Cas9(SpCas9)的表达单元、第一Cas9自靶向sgRNA和靶向选择的基因组基因座的第二sgRNA组成。所述自限制性回路通过控制Cas9水平导致增加的基因组编辑特异性。对于其体内利用，SLiCES被经由回路抑制整合到慢病毒递送系统(lentiSLiCES)中以实现病毒颗粒产生。在将其递送到靶细胞后，lentiSLiCES回路被打开以编辑预期的基因组基因座，同时通过SpCas9失活增加其自身中和。通过保护靶细胞免于残留的核酸酶活性，本打了就跑系统增加了基因组编辑的安全系数。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于CRISP/Cas9技术和相关慢病毒颗粒的表达单元。

背景技术

CRISPR/Cas9技术的体内应用仍然受到不想要的Cas9基因组切割的限制。Cas9的长期表达增加了被核酸酶非特异性切割的基因组基因座的数量。

通过CRISPR/Cas9技术进行的基因组编辑因其简单性、靶设计可塑性和多重靶向能力而具有用于基础和临床应用两者的巨大潜力。CRISPR/Cas9使用的主要限制是在与预期靶标不同的位点处诱导的突变。这对体内应用至关重要，因为不想要的改变可以导致不利的临床结果。

影响脱靶修饰的数量的重要因素是在靶细胞中SpCas9表达的量和持续：据报道高浓度的核酸酶增加脱靶切割，而降低SpCas9的量增加特异性。瞬时SpCas9表达确实足以以降低的脱靶活性永久性地修饰靶基因组基因座，如通过将重组SpCas9-sgRNA复合物直接递送到靶细胞中而获得的增强的特异性(Kim,S.等,Genome Res.2014,24,1012–1019；Ramakrishna,S.等,Genome Res.2014,24,1020–1027；Zuris,J.A.等,Nat.Biotechnol.2015,33,73–80)或者通过使用被内含肽激活的SpCas9变体(Davis,K.M.等,Nat.Chem.Biol.2015,11,316–318)所证实的。可能的是在靶基因座已经被编辑之后存在的任何Cas9蛋白具有修饰另外的位点的很大可能性。即使SpCas9-sgRNA核糖核蛋白复合物的直接递送可以降低脱靶效应，但效率非常低并且不适合体内方法。

Slaymaker,I.M.等(Science 2016,351,84–88)描述了具有改善的特异性的理性地工程化的Cas9核酸酶。

虽然病毒载体是最佳的递送工具，但它们产生对CRISPR/Cas9应用不一定有益的转移的因子的稳定表达。已知Cas9的量和持续导致脱靶积累，并且通过慢病毒系统永久递送的Cas9导致在脱靶位点处的插入缺失的持续的、时间上的增加。

最近通过利用各种诱导型系统，开发了旨在控制Cas9活性的方法(J.K.等,ACS Chem.Biol.2016,11,681–688)。尽管如此，迄今为止报道的方法受损于从核酸酶分裂(Wright,A.V.等,Proc.Natl.Acad.2015,291 Sci.U.S.A.112,2984–2989)或化学修饰(Davis,K.M.等,Nat.Chem.Biol.2015,11,316–318)导致的编辑活性降低到背景活性(Nihongaki,Y.等,Nat.Biotechnol.2015,33,755–760)或延长的所需诱导的时间(Zetsche,B.等,Nat.Biotechnol.2015,33,139–142)的许多限制。

Kiani S.等(Nat Methods.2015,12(11):1051–1054)公开了通过改变Cas9相关指导RNA(gRNA)的长度，可以控制Cas9核酸酶活性，并同时用单个Cas9蛋白进行基因组编辑和转录调节。