[发明专利]新颖的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶

说明书

提供了一种新颖的内‑β‑N‑乙酰基氨基葡糖苷酶，其分离自属于根毛霉菌属的真菌且在高温条件下是有活性的；其各种突变体酶；编码所述酶的基因；重组质粒；通过所述重组质粒转化的转化体；等。

技术领域

本发明涉及在高温条件下有活性的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶、编码所述酶的基因、重组质粒、用所述质粒转化的转化体等。

背景技术

糖蛋白广泛地存在于动物和植物的组织、真核微生物的细胞膜和细胞壁等中。近年来，已经揭示糖蛋白中的糖链在诸如细胞分化、致癌作用和细胞间识别等机制中具有重要作用。为了阐明这些机制，已经进行了对糖链的结构和功能之间的关联的研究。在药物发现研究中，已经进行了尝试诸如糖链的重构（其中将包括抗体在内的糖蛋白中的糖链替换为均匀糖链结构）和肽或小分子的糖基化。这样的药物发现研究经常使用用酶（诸如内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶）从具有均匀糖链的天然存在的糖蛋白/糖肽切下来的糖链。

动物糖蛋白中的代表性糖链包括附着于天冬酰胺侧链的N-连接的糖链。N-连接的糖链根据它们的结构分类为高甘露糖型、杂合型和复杂型，但是具有壳二糖结构（其具有2个与还原端连接的GlcNAc残基）作为共同结构。内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶是具有以下活性的酶：水解所述壳二糖结构中的糖苷键的活性，和将切割的糖链转移到具有特定结构的受体上的转糖基活性。已经从多个生物物种分离出的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶具有各种不同的底物特异性。不同的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶已经被用于不同的目的。在这些中，已经报道使用复杂型糖链作为底物的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶包括如下所述的那些。

Endo-M是一种从冻土毛霉（Mucor hiemalis）衍生出的酶，当将对高甘露糖型Man8GlcNAc2的活性设定为100%时，该酶对复杂型双天线糖链（无半乳糖（agalacto）双天线PA糖）具有的底物特异性是4.4%的活性(非专利文献1: Fujita等人, (2004) ArchBiochem Biophy. 432: p41-49)。在相同文献中报道，在大肠杆菌（Escherichia coli）中在37℃的所有表达诱导中Endo-M被表达为不溶性聚集体，且诱导温度变成20℃导致可溶性级分中的低酶活性，因而在酵母中尝试了Endo-M的表达。因而，据信，难以在大肠杆菌中适当地表达Endo-M。还已知Endo-M在40℃或更高温度失活。

已经报道，Endo-Om是一种从酵母Ogataea minuta衍生出的酶(专利文献1:WO2013/051608或US2014-0313246)，该酶使用复杂型糖链作为底物且在水解反应中具有50℃的最适温度。Endo-Om在除了酵母以外的生物中的表达是未知的。

Endo-F2和Endo-F3是从Elizabethkingia miricola衍生出的酶(非专利文献2:Tarentino AL等人, (1993) J Biol Chem. 268: p9702-9708)。Endo-F2水解高甘露糖型和双天线复杂型糖链且对杂合型糖链没有水解活性。另一方面，Endo-F3水解双天线或三天线复杂型糖链且对高甘露糖型和杂合型糖链没有水解活性。

Endo-S（它是一种从酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）衍生出的酶）仅水解双天线复杂型糖链且对高甘露糖型和杂合型糖链没有水解活性(非专利文献3:Goodfellow JJ等人, (2012) J Am Chem Sci. 134: p8030-8033)。

Endo-CE（它是一种从秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）衍生出的酶）水解高甘露糖型和双天线复杂型糖链，且未知Endo-CE是否可以切割杂合型糖链(非专利文献4:Kato T等人, (2002) Glycobiology 12: p581-587)。据报道Endo-CE在水解反应中具有20℃的最适温度。