[发明专利]由浮力实现的分离方法和系统

说明书

一种由浮力实现的分离方法，其用于从包括各种不同细胞的样品分离出通过多种不同细胞表面标志物区分的稀少子类别细胞。将与抗体缀合的微泡按顺序地施加到容器中，所述容器具有在施加下一种与不同抗体缀合的微泡之前被破坏的先前使用的微泡。一种包括具有柱塞和可封闭开口的注射器样容器的系统。进一步地，一种通过应用具有柔性脂质壳的抗原呈递微泡来激活和扩增分离的T细胞的方法，所述微泡模拟抗原呈递细胞用以形成免疫突触。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年12月16日提交的第62/435,083号美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

关于联邦政府资助研究的声明

该发明是在国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的名为1R43CA176892-01A1、3R43CA176892-01A1S1、2R44CA176892、1R43HL126285-01、2R44HL126285-02A1和HHSN261201700051C的政府支持下完成的。政府对本发明拥有某些权利。

发明领域

本发明涉及一种用于细胞和其它生物剂的大量分离、连续多标志物分选、刺激、操作、培养和扩增的简单的端对端装置和系统。

发明背景

所有细胞治疗的主要挑战是需要开发具有成本效益的和有效的制造和递送能力，如创建可扩展的、自动化的封闭系统以分离子类别T细胞。例如，在小鼠和人中的研究表明，输注用嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)基因工程化的较低分化的T细胞导致优异的T细胞扩增、持久性，以及癌症消除。分选和分离子类别T细胞(例如初始CD8+细胞)需要多种标志物(例如CD8、CD62L和CD45RA)，这对于放大和自动化是具有挑战性的。

FACS(荧光激活的细胞分选)是最常用于单一细胞的详细分析的产品。使用FACS，难以放大细胞的大量分离。磁性细胞分选(MACS)技术，特别是Miltenyi系统，被用于靶细胞的大量分离。与微珠(例如Dynabeads)结合的细胞可以通过混合管外部的外部磁体抽出。然而，将抗体缀合的微珠与细胞结合，而不是单独的抗体或抗体缀合的纳米珠结合减慢了该过程。因此，市场上的大多数磁性细胞分选系统使用纳米珠而不是微珠缀合的抗体。MACS最大问题之一是与磁性微粒(1μm)偶联的分离的细胞经常被破坏。

现有的MACS技术应用高梯度磁性细胞分离柱来在磁场中磁化纳米珠标记的细胞，所述磁场是由强外部磁体产生的。MACS使用铁磁钢和羊毛填充的柱来加强低磁性纳米珠和外部磁体之间的长距离相互作用。然而，在该系统中使用钢和羊毛填充的柱产生其它技术问题，像柱堵塞和制造成本增加。此外，MACS纳米珠粘附于靶细胞，或者在细胞表面上或通过内吞作用而在内部。这将MACS的应用主要限制在基于单个表面标志物的细胞富集。

如以公开号WO2015/175344A1公布的国际专利申请中所描述的，已经开发了用于细胞分离的BUBLES(由浮力实现的分离)或浮力激活的细胞分选(BACS)技术，其应用靶微泡用于分离细胞。

对于多参数的MACS，现有技术包含一些实现细胞和亲和配体缀合的磁珠的可逆结合的方法。这些方法是通过按顺序靶向多个细胞表面标志物开发的。例如，Streptamer技术通过与Strep-Tactin多聚化的低亲和力单链抗体缀合实现磁性微粒(～1μm)的可逆靶细胞结合，所述Strep-Tactin多聚化的低亲和力单链抗体已被工程化从而与Strep标签融合。现有技术中的其它技术使用能与细胞或磁珠分离的修饰抗体。这些方法通常需要对目标抗体的大量修饰，并且可以应用于MACS之外的其它平台，如FACS、BACS和其它形式的亲和纯化。