[发明专利]甜菊醇糖苷的生物合成生产及其工艺

权利要求书

1.一种制备甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括：

准备包含以下的反应混合物：

(a)具有以下结构的莱鲍迪苷W：

和

(b)β-葡糖苷酶；且

将所述反应混合物孵育足够的时间以产生包含莱鲍迪苷WB1、莱鲍迪苷WB2或其组合的甜菊醇糖苷组合物，其中莱鲍迪苷WB1具有以下结构：

和

莱鲍迪苷WB2具有以下结构：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-葡糖苷酶是具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)β-葡糖苷酶。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括获得包含莱鲍迪苷WB1的粗产物。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括将莱鲍迪苷WB1与UDP-糖基转移酶一起孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷D4，其中所述UDP-糖基转移酶是HV1UGT酶，并且莱鲍迪苷D4具有以下结构：

5.根据权利要求4所述的方法，其中在蔗糖和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)的存在下将所述UDP-糖基转移酶与蔗糖合酶一起孵育。

6.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括将莱鲍迪苷D4与UDP-糖基转移酶一起孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷M，其中所述UDP-糖基转移酶是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的UGT76G1。

7.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括将莱鲍迪苷D4与UDP-糖基转移酶一起孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷M，其中所述UDP-糖基转移酶包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

8.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括将莱鲍迪苷D4与UDP-糖基转移酶一起孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷M，其中所述UDP-糖基转移酶是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的酶的突变体，其中所述突变体包含在对应于选自SEQ ID NO:3的3、6、90、91、93、181、183、184、185、350、389、410、418、450、451、452和454的位置的氨基酸残基位置处的至少一个突变。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，所述方法还包括获得从所述反应混合物产生的用作甜味剂的莱鲍迪苷M。