[发明专利]甜菊醇糖苷的生物合成生产及其工艺

说明书

本发明涉及甜菊醇糖苷莱鲍迪苷D4、WB1和WB2的生产以及从Reb D4生产莱鲍迪苷M。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年10月14日提交的美国临时申请号62/408,179和2017年9月8日提交的美国临时申请号62/555,809的优先权，其中每个的内容通过引用以其全部结合于此。

技术领域

本发明的领域涉及有用于生产特定甜菊醇糖苷的方法和工艺。更具体地，本公开内容提供了生产先前未知的莱鲍迪苷(rebaudioside)，莱鲍迪苷D4(“Reb D4”)，莱鲍迪苷D4然后可以通过酶促转化为莱鲍迪苷M(“Reb M”)。本公开还提供了生产先前未知的莱鲍迪苷，莱鲍迪苷WB1(“Reb WB1”)和莱鲍迪苷WB2(“Reb WB2”)。

背景技术

本公开集中于新型莱鲍迪苷Reb D4、Reb WB1和Reb WB2的生产以及Reb D4向RebM的转化。具体地，本公开涉及Reb D4的合成及其随后在生产Reb M中的用途。

甜菊醇糖苷是从甜叶菊(Stevia rebaudiana)叶中分离的天然产物，并且广泛用作食品、饲料和饮料中的高强度、低热量甜味剂。天然存在的甜菊醇糖苷具有相同的碱二萜结构(甜菊醇)，但在甜菊醇骨架的C13和C19位置上碳水化合物残基(例如葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)修饰的数量和结构不同。具有已知结构的甜菊醇糖苷包括甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷M和杜克苷(dulcoside)A。就商业应用而言，莱鲍迪苷M本身通常被认为是安全的(‘GRAS’状态)。

基于干重，甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C和杜克苷A分别占野生型甜叶菊叶中的甜菊醇糖苷总重量的9.1％、3.8％、0.6％和0.30％，而其他甜菊醇糖苷(例如Reb M)以低得多的量存在。来自甜叶菊植物的提取物是可商购的，其中此类提取物通常含有甜菊苷和莱鲍迪苷A作为主要组分。其他已知的甜菊醇糖苷通常作为次要或微量组分存在于甜叶菊提取物中。例如，莱鲍迪苷A在商业制品中的量可以从总的甜菊醇糖苷含量的约20％至多于90％变化，而莱鲍迪苷B的量通常是总的甜菊醇糖苷的约1-2％，莱鲍迪苷C的量可以是总的甜菊醇糖苷的约7-15％，莱鲍迪苷D的量可以是总的甜菊醇糖苷的约2％。在这样的提取物中，莱鲍迪苷M仅以极少量存在。有趣的是，莱鲍迪苷E也是甜叶菊植物品种中存在最少的甜菊醇糖苷之一，占总糖苷的不到0.5％。

作为天然甜味剂，不同甜菊醇糖苷具有不同程度的甜味、“口感”和与所测试的每种莱鲍迪苷种类相关的特定后味。相对于食糖(即“蔗糖”)，甜菊醇糖苷的甜度显著更高。例如，甜菊苷比蔗糖甜100-150倍，但味道测试中有苦的后味，而莱鲍迪苷A和E比蔗糖甜250-450倍，并且后味比甜菊苷好得多，但是，仍有明显的后味。因此，任何甜叶菊提取物的味道特征深受提取物中甜菊醇糖苷的相对含量的影响，这反过来可能受到地下植物所经历的环境条件和所用提取方法的影响。植物产量，天气条件和提取条件的这些变化可导致甜叶菊提取物中甜菊醇糖苷的组成不一致，使得不同批次的提取产物之间的味道特征变化很大。

甜叶菊提取物的味道特征也可以受到提取工艺后残留在产物中的植物来源的或环境来源的污染物(比如色素、脂类、蛋白类、酚类和糖类)影响。这些污染物通常其自身具有异味，这对于使用甜叶菊提取物作为消费品中的甜味剂是不合需要的。此外，分离甜叶菊提取物中不丰富的甜菊醇莱鲍迪苷的单独或特定组合的成本是花费和资源过高的。鉴于某些特定甜菊醇糖苷的质量和可用性有限，商业供应可以通过生物转化更好地解决，其中天然酶或特定微生物可以被修饰以携带所需的酶并使用商业上重要的发酵过程来特异性地增加目的糖苷的生产。例如，先前已经报道了使用从经修饰的微生物获得的酶将甜菊苷生物转化为Reb E(参见例如PCT申请公开号WO/2015/065650和WO/2015/171555)。或者，其他非生物合成手段可用于开发目的甜菊醇糖苷。