[发明专利]液滴加标的相邻性保留的标签化DNA

权利要求书

1.一种确定单倍型基因组序列信息的方法，所述方法包括：

提供基因组DNA的片段；

将所述片段与载有衔接体的标签酶反应，所述载有衔接体的标签酶产生由片段中断裂点限定的DNA片段并在所述断裂点插入衔接体，其中所述反应处于使得所述标签酶结合所述断裂点以形成连接的DNA区段的条件下，所述连接的DNA区段为DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体-(DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体)_n-DNA区段的形式，其中n是任何整数并且“-”表示共价连接；

将连接的DNA区段包封在分区中，所述分区包含：

珠，所述珠具有正向引物寡核苷酸，所述正向引物寡核苷酸通过所述正向引物寡核苷酸的5'端与所述珠连接，所述正向引物寡核苷酸具有珠特异性条码以及对所述第一或第二衔接体具有特异性并与其互补的3'端；

反向引物寡核苷酸，所述反向引物寡核苷酸具有与所述第一或第二衔接体互补的3'端，其中所述正向引物3'端和所述反向引物3'端与选自所述第一衔接体和所述第二衔接体的不同衔接体互补；

从所述分区中的所述区段置换出所述标签酶；

进行扩增，其中所述正向引物和所述反向引物寡核苷酸由所述DNA区段生成扩增子，从而用所述珠条码条码化分区内的扩增子；

合并所述分区以形成包含所述扩增子的反应混合物；和

对扩增子进行核苷酸测序。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述分区包含一定量的试剂，所述试剂从所述区段置换出所述标签酶但是不抑制聚合。

3.如权利要求1所述的方法，其中，在扩增之前，插入的衔接体的单链区被DNA聚合酶填平。

4.如权利要求1所述的方法，其中，在扩增之前，片段化的靶核酸的单链区被DNA聚合酶填平。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述正向引物寡核苷酸由所述珠释放，并且扩增发生在溶液中。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述试剂是去污剂。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述SDS的浓度是0.005-0.05％(例如，0.01-0.04％，例如，0.01-0.02％)。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述片段平均为5-10Mb。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述分区是乳液中的液滴。

11.如权利要求1所述的方法，其中，所述包封将平均0.02-3(例如，0.05-1，0.08-0.5，例如，0.1、1、2或3)个珠包封于分区中。

12.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因组DNA来自单细胞。

13.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因组DNA来自哺乳动物或植物。

14.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一衔接体和所述第二衔接体具有不同的序列。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述第一衔接体和所述第二衔接体的相同性小于50％。

16.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一衔接体和所述第二衔接体具有相同的序列。

17.如权利要求1所述的方法，其中，当所述第一衔接体和所述第二衔接体加载到所述连接酶时，所述第一衔接体和所述第二衔接体通过连接序列连接，从而使所述DNA区段通过所述标签酶和所述连接序列两者连接。