[发明专利]液滴加标的相邻性保留的标签化DNA

说明书

提供了用于保持测序的DNA相邻性的组合物和方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月19日提交的美国临时专利申请号62/436,288的优先权，该文通过引用纳入本文。

背景技术

单倍型信息在许多遗传分析中可能是有价值的。然而，由于不能保持相邻性，因此很难从许多测序方法中获得关于单倍型的信息。Amini等Nature Genetics 46(12):1343-1349描述了保持相邻性的一种方法，但是该方法包括许多单独的反应，各反应需要显著的酶(例如，标签酶(tagmentase))。

发明内容

在一些实施方式中，提供了确定单倍型基因组序列的方法。在一些实施方式中，该方法包括：

提供基因组DNA的片段；

将片段与载有衔接体的标签酶反应，所述载有衔接体的标签酶产生由片段中断裂点限定的DNA片段并在断裂点插入衔接体，其中该反应处于标签酶结合断裂点以形成连接的DNA区段的条件下，所述连接的DNA区段处于DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体-(DNA区段-第一衔接体-标签酶-第二衔接体)n-DNA区段的形式，其中n是任何整数并且“-”表示共价连接；

将连接的DNA区段包封在分区(partition)中，所述分区包含：

珠，该珠具有正向引物寡核苷酸，所述正向引物寡核苷酸通过正向引物寡核苷酸的5'端与珠连接，所述正向引物寡核苷酸具有珠特异性条码以及对第一或第二衔接体具有特异性并与其互补的3'端；

反向引物寡核苷酸，所述反向引物寡核苷酸具有与第一或第二衔接体互补的3'端，其中正向引物3'端和反向引物3'端与选自第一衔接体和第二衔接体的不同衔接体互补；

置换分区中区段的标签酶；进行扩增，其中正向引物和反向引物寡核苷酸由DNA区段生成扩增子，从而使分区内的扩增子被珠条码条码化；

合并分区以形成包含扩增子的反应混合物；和

对扩增子进行核苷酸测序。

在一些实施方式中，分区包含一定量的试剂，所述试剂从区段置换出标签酶但是不抑制聚合。在一些实施方式中，该试剂是聚合酶。在一些实施方式中，该试剂是去污剂。在一些实施方式中，将标签酶热置换。

在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，扩增之前，插入的衔接体的单链区被DNA聚合酶填平。在一些实施方式中，该填平在过程中从区段置换出标签酶。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，扩增之前，片段化的靶核酸的单链区被合并上述任何实施方式的DNA聚合酶填平。在一些实施方式中，正向引物寡核苷酸由珠释放，并且扩增发生在溶液中。

在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，试剂是去污剂。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，SDS的浓度是0.005-0.05％(例如，0.01-0.04％，例如，0.01-0.02％)。

在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，片段平均为5-10Mb。

在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，分区是乳液中的液滴。

在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，包封将平均0.02-3(例如，0.05-1，0.08-0.5，例如，0.1、1、2或3)个珠包封于分区中。

在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，基因组DNA来自单细胞。在合并上述任何实施方式的一些实施方式中，基因组DNA来自哺乳动物或植物。