[发明专利]具有高热稳定性的可逆保护的核苷酸试剂

说明书

本发明提供了用于通过PCR和RT‑PCR(逆转录酶‑PCR)进行核酸扩增的稳定核苷酸试剂，其包含修饰的核苷多磷酸。本发明还提供了用于使用修饰的核苷多磷酸用于在扩增反应中检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法。

发明领域

本发明提供了稳定的核苷酸试剂、它们的制备方法、它们的使用方法和包含它们的试剂盒。所述核苷酸试剂可用于许多重组DNA技术、特别是通过聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增中。

发明背景

核酸扩增试剂通常由温度敏感组分构成，且因此通常必须在远低于环境温度的温度下储存和运输。对于脱氧核苷三磷酸或其核糖核苷三磷酸类似物尤其如此。这些试剂易于经由从末端失去连续的磷酸酯基团而降解，导致形成核苷二磷酸和单磷酸，这二者都不再具有作为核酸聚合酶底物的活性。通过酯化末端磷酸酯可以非常显著地改善核苷多磷酸的稳定性。例如，g-甲基-dNTP类似物在足以完全降解正常dNTP的热应激条件下是完全稳定的。然而，末端磷酸酯的酯化可以对这些核苷酸充当某些聚合酶的有效底物的能力具有负面影响。需要具有核苷酸三磷酸，其是热稳定的并且最初作为底物的无活性或具有降低的活性，但容易通过简单的化学或酶促步骤活化。

发明概述

本发明提供了用于通过PCR和RT-PCR(逆转录酶-PCR)进行核酸扩增的稳定核苷酸试剂，其包含修饰的核苷多磷酸。本发明还提供了用于使用修饰的核苷多磷酸用于在扩增反应中检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法。

因此，在一个方面，本发明涉及检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法，其包括：进行扩增步骤，其包括使样品与扩增试剂接触，如果样品中存在靶核酸序列则产生扩增产物；和检测扩增产物，其中所述扩增试剂包含具有以下结构的修饰的核苷多磷酸：

其中B =嘌呤或嘧啶碱基或类似物，L=接头或无，Z=标记物或无，R=OH或O^-，R₁和R₂= H或OH，n =1-7，X= O、S或NH，Y=可以化学或酶促除去的有机部分。在一个实施方案中，X=O且Y=可以通过还原剂化学除去的有机部分。在另一个实施方案中，所述还原剂选自膦衍生物、亚硫酸钠(Na₂SO₃)、β-巯基乙醇和二硫苏糖醇。在另一个实施方案中，所述膦衍生物是三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)。在另一个实施方案中，Y是HO-CH₂-CH₂-S-S-CH₂-CH₂-。在一个实施方案中，X=O且Y=可以通过酯酶酶促除去的有机部分。在另一个实施方案中，所述酯酶是羧酸酯酶。在又另一个实施方案中，Y选自CH₃C(O)-S-CH₂-CH₂-和CH₂CH₂C(O)OCH₂-。在一些实施方案中，所述扩增步骤重复至少一次。在一些实施方案中，所述扩增步骤重复至少约20次，但可以重复多达至少40次、至少60次或至少100次。在一些实施方案中，所述扩增产物在扩增发生后检测一次。在一些实施方案中，在所述扩增步骤期间和/或之后检测所述扩增产物。在一些实施方案中，在3个、5个、10个、20个、30个、40个或50个扩增步骤期间和/或之后或在每个扩增步骤期间和/或之后，在定义的时间点检测所述扩增产物。

在另一个方面，本发明涉及使用扩增试剂扩增靶核酸序列的方法，其中所述扩增试剂包含具有以下结构的修饰的核苷多磷酸：