[发明专利]病毒颗粒和病毒样颗粒的超敏感检测

说明书

本发明涉及一种定量和/或定性测定病毒颗粒的方法，该病毒颗粒包含至少一个捕获分子的结合位点和至少一个探针的结合位点，本发明还涉及用于实施所述方法的试剂盒，以及各种用途。

技术领域

本发明涉及一种定量和/或定性测定病毒颗粒的方法，所述病毒颗粒包含至少一个捕获分子的结合位点和至少一个探针的结合位点，还涉及用于实施所述方法的试剂盒，以及各种用途。

背景技术

病毒被定义为感染性颗粒，其只能在合适的宿主细胞内繁殖。病毒由核酸(DNA或RNA)、蛋白质构建，在某些情况下，还包含脂质。它们还包括感染细菌的噬菌体。由于它们都没有独立的复制能力或自身的新陈代谢机制，因此根据流行的观点，它们不能被归类为生物体。单个病毒颗粒由上述核酸和蛋白质外壳的基因组组成。有些还有另外的外壳。这种完整的感染性病毒颗粒代表病毒的细胞外形式，也称为病毒粒子。由于感染性病毒颗粒很小，根据物种其大小在15nm和300nm之间，所以迄今为止只知道少数的直接检测方法；大多数检测基于受感染细胞或受感染生物体的症状。当病原体(例如病毒颗粒)主动或被动地在生物体中穿透、保留并随后繁殖时，这通常被称为感染。如果宿主细胞可以归类为原核生物，则感染性病毒颗粒被称为噬菌体。

由于颗粒尺寸小，所以使用电子显微镜作为迄今为止仅有的直接检测病毒颗粒的方法。这涉及基于其作为颗粒的性质来检测病毒。除了合适设备的高成本之外，电子显微镜仅能够区分不同的病毒科，但不能确定相应的亚种。此外，样品必须是化学或物理固定的，结果是功能蛋白质不再可用或表位变性或掩蔽。此外，需要存在大量病毒颗粒。

根据现有技术，通过功能性的基于抗体或基于基因组的技术检测病毒或病毒组分，例如，基于PCR的病毒RNA或DNA的增殖以及通过杂交依赖性探针鉴定。

通过利用细胞病变效应的噬斑测定法检测功能性病毒。未登记灭活病毒或非感染性粒子。与病毒颗粒的量相比，基于基因组的技术更多地用于定量病毒RNA/DNA的量。

在Western印迹法中可以用抗体检测病毒蛋白的连续表位。

在强烈怀疑病毒感染的情况下以及当其他检测方法未能提供阳性结果时，使用PCR技术。该技术涉及通过使用病毒特异性引物的聚合酶链反应扩增基因组。在RNA病毒的情况下，需要通过逆转录酶将RNA转录成DNA。通过特异性探针杂交或通过扩增DNA的非特异性染色和凝胶电泳后的尺寸依赖性鉴定来检测扩增子。

基于PCR的方法必须费力地校准，其不是严格定量的并且非常容易受到污染，这可能导致假阳性结果。实际上，它们确定病毒DNA/RNA的存在，或者有时甚至仅确定其部分。另外，抑制PCR反应的样品组分可能导致假阴性结果。因此，在分析样品之前始终必须对样品进行纯化。

检测内源性抗病毒抗体的免疫测定通常只在感染后数周(诊断缺口)得到阳性结果。ELISA方法通常仅检测病毒的亚片段而不是完整颗粒的存在。

发明内容

本发明的一个目的是提供病毒颗粒的超灵敏检测。本发明的另一个目的是提供一种方法，该方法允许以尽可能少的量检测任何样品中的病毒颗粒和病毒样颗粒，因此甚至可以在任何样品中进行单独检测，特别是对于不可培养的病毒。因此，该方法可以检测病毒感染以及任何样品中的污染。

此外，本发明的意图在于不仅可以定性检测病毒颗粒，而且还可以定量和表征任何样品中的病毒颗粒。因此，本发明的意图在于首先确保颗粒数的直接和绝对定量，其次，确保对病毒颗粒的精确表征，从而使得分型成为可能。本发明的意图在于将该结果用于治疗以及诊断、差异诊断和/或病毒组装分析。

此外，本发明的意图还在于该方法还可确保检测蛋白质-蛋白质相互作用，即宿主-病毒相互作用。

本发明的意图在于以几个简单的步骤直接从任何样品进行检测，任何样品例如体外体液或尸检或活检材料、器官以及来自环境的样品，例如水样品、植物样品和土壤样品以及食品。