[发明专利]使用MITRA尖端提取检测囊性纤维化突变的方法

说明书

本公开文本提供了用于确定表现出囊性纤维化症状的患者或有囊性纤维化风险的患者是否将受益于用一种或多种抗囊性纤维化治疗剂进行的治疗的方法。这些方法基于在使用体积计量吸收微量取样装置收集的小体积干生物流体样品中检测遗传性囊性纤维化相关突变。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。

技术领域

本公开文本提供了用于确定表现出囊性纤维化症状的患者或有囊性纤维化风险的患者是否将受益于用一种或多种抗囊性纤维化治疗剂进行的治疗的方法。这些方法基于在使用体积计量吸收微量取样装置收集的小体积干生物流体样品中检测遗传性囊性纤维化相关突变。可以使用下一代测序(NGS)检测对应于一种或多种囊性纤维化相关突变的靶核酸序列的改变。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。

背景技术

下文提供对本公开文本的背景的说明只为了帮助读者理解本公开文本，并且并不承认描述或构成本公开文本的现有技术。

囊性纤维化(CF)是高加索人群中最常见的严重常染色体隐性遗传性障碍。它影响北美大约1/2,500的活产儿(Boat等人,The Metabolic Basis of Inherited Disease,第6版,第2649-2680页,McGraw Hill,NY(1989))。北欧高加索人后裔中大约有1/25人是所述疾病的携带者。负责基因位于7号染色体长臂上存在的250,000个碱基对基因组序列中。该序列编码称为“囊性纤维化跨膜调节因子”(或“CFTR”)的膜相关蛋白。CFTR基因中存在超过1000种不同的突变，每种突变在不同群体中具有不同的发生频率，目前报告给囊性纤维化遗传分析联盟(Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium)。这些突变存在于CFTR基因的编码区(例如ΔF508，在约70％的CF等位基因中发现的突变，代表508位处苯丙氨酸残基的缺失)和非编码区(例如5T、7T和9T变体对应于位于内含子8的剪接分支/受体位点处具有5、7或9个胸苷碱基的序列)。

囊性纤维化的主要症状包括慢性肺病、胰腺外分泌功能不全和汗液电解质水平升高。症状与囊性纤维化是外分泌障碍一致。尽管目前在分析跨越CF患者细胞上皮顶膜的离子转运方面取得了进展，但尚不清楚氯离子通道的异常调节是否代表了所述疾病的主要缺陷。

下一代测序(NGS)广泛用于遗传性障碍，包括囊性纤维化的诊断，因为其具有高数据通量并且能够在单次测定中检测多种基因改变。然而，与从生物样品(例如血液)收集和制备核酸相关的程序通常是麻烦的，通常需要专门的设备或技术技能。此外，某些患者群诸如老人或幼儿不能提供大量血液用于反复测试。

因此，需要快速且非侵入性方法来确定患者是否具有产生囊性纤维化的遗传基础或有产生罹患囊性纤维化的后代的风险。

发明内容

一方面，本公开文本提供了一种用于检测样品CFTR核酸中的至少一种突变的方法，所述方法包括(a)从自微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取样品CFTR核酸；(b)产生包含对应于样品CFTR核酸的多个靶区段的扩增子的文库；以及(c)使用高通量大规模平行测序检测文库中扩增子中的至少一个中的至少一种突变。

另外或可替代地，在一些实施方案中，干生物流体样品是干血浆、干血清或干全血。在一些实施方案中，微量取样装置的吸收尖端上的干生物流体样品是通过手指针刺从患者收集的。在一些实施方案中，微量取样装置是体积计量吸收微量取样装置。在某些实施方案中，微量取样装置是尖端。

另外或可替代地，在一些实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液和蛋白酶K接触来进行的。在某些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。在另一个实施方案中，裂解缓冲液包含800mM盐酸胍；30mM Tris·Cl，pH8.0；30mM EDTA，pH 8.0；5％Tween 20；以及0.5％Triton X-100。在其他实施方案中，裂解缓冲液包含2.5％-10％十二烷基硫酸钠。