[发明专利]利用自动化遗传操作和菌株纯化步骤建立真菌生产菌株的方法

权利要求书

1.一种生产丝状真菌菌株的方法，所述方法包括：

a.)提供多个原生质体，其中所述原生质体由丝状真菌细胞培养物制备；

b.)用第一构建体和第二构建体转化所述多个原生质体，其中所述第一构建体包括第一多核苷酸，所述第一多核苷酸在两侧由与所述原生质体的基因组中的第一基因座同源的核苷酸侧接，并且所述第二构建体包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸在两侧由与所述原生质体的基因组中的第二基因座同源的核苷酸侧接，其中转化引起所述第一构建体通过同源重组整合到所述第一基因座中并且所述第二构建体通过同源重组整合到所述第二基因座中，其中至少所述第二基因座是所述原生质体基因组中的第一可选择标记基因，并且其中所述第一多核苷酸包括突变和/或遗传控制元件；

c.)通过进行选择和反选择来纯化同核转化体；和

d.)在有利于所述丝状真菌细胞的再生的培养基中使所述经过纯化的转化体生长。

2.一种生产丝状真菌菌株的方法，所述方法包括：

a.)提供多个原生质体，其中所述原生质体由丝状真菌细胞培养物制备；

b.)用第一构建体和第二构建体转化所述多个原生质体，其中所述第一构建体包括第一多核苷酸，所述第一多核苷酸由与所述原生质体的基因组中的基因座同源的核苷酸侧接，并且所述第二构建体包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸由与所述原生质体的基因组中的所述基因座同源的核苷酸侧接，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸包括可选择标记的互补部分，并且其中所述第一构建体和/或所述第二构建体进一步包括突变或遗传控制元件，其中转化引起所述第一和第二多核苷酸以及所述突变或遗传控制元件通过同源重组整合到所述基因座中；

c.)通过进行选择和反选择来纯化同核转化体；和

d.)在有利于所述丝状真菌细胞的再生的培养基中使所述经过纯化的转化体生长。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中来自所述多个原生质体的每个原生质体用来自多个第一构建体的单个第一构建体和来自多个第二构建体的单个第二构建体转化，其中来自所述多个第一构建体的每个第一构建体中的所述第一多核苷酸包括不同的突变和/或遗传控制元件；并且其中来自所述多个第二构建体的每个第二构建体中的所述第二多核苷酸是相同的。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括重复步骤a-d以生成丝状真菌细胞文库，其中所述文库中的每个丝状真菌细胞包括具有不同突变和/或遗传控制元件的第一多核苷酸。

5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述第一多核苷酸编码靶丝状真菌基因或异源基因。

6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述突变是单核苷酸多态性。

7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述遗传控制是启动子序列和/或终止子序列。

8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述多个原生质体分布在微量滴定板的孔中。

9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中步骤a-d在微量滴定板的孔中进行。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述微量滴定板是96孔、384孔或1536孔微量滴定板。

11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自绵霉属、支顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢子菌属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、栗疫属、隐球菌属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内座壳属、镰刀菌属、赤霉菌属、粘帚霉属、腐质霉属、肉座菌属、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)、毛霉属、脉孢菌属、青霉菌属、柄孢壳菌属、射脉菌属、梨囊鞭菌属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、柱顶孢霉属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、栓菌属、弯颈霉属、木霉属、轮枝菌属、小包脚菇属物种或其有性型或无性型，及其同义词或分类学等价物。