[发明专利]利用自动化遗传操作和菌株纯化步骤建立真菌生产菌株的方法

说明书

本公开提供了一种利用自动化来转化、筛选和选择丝状真菌细胞的高通量HTP微生物基因组工程化改造方法和系统。所述方法和系统利用HTP选择和反选择来纯化同核转化丝状真菌细胞。此外，本公开提供了一种生产和长期储存源自丝状真菌细胞的原生质体的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月30日提交的美国临时申请序列号62/441,040的优先权，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。

技术领域

本公开涉及自动化真菌基因组工程化改造。所公开的自动化基因组工程化改造平台需要对丝状真菌进行遗传操作以生成真菌生产菌株并促进其纯化。所得的真菌生产菌株非常适用于在浸没培养物中生长，例如适用于大规模生产用于商业应用的目标产物(例如，抗生素、代谢物、蛋白质等)。

背景技术

真核细胞是生产多肽和次级代谢物的优选有机体。事实上，丝状真菌能够高水平表达天然和异源蛋白质，使其非常适用于大规模生产工业、制药、动物健康和食品和饮料应用的酶和其它蛋白质。然而，使用丝状真菌大规模生产目标产物通常需要对所述真菌进行遗传操作以及使用自动化机械和设备，并且丝状真菌生命周期的某些方面可能使遗传操作和处理变得困难。

例如，引入真菌中的DNA在基因组内随机整合，从而产生在大多数情况下随机整合的DNA片段，其通常可以整合为多个串联重复(参见例如卡斯凯罗(Casqueiro)等人，1999年，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，181:1181-1188)。表达盒的这种不受控制的“随机多重整合”可能是潜在的有害过程，其可能导致宿主基因组的不希望的修饰。

另外，目前用于丝状真菌的转染系统可能非常吃力(综述参见芬查姆(Fincham)，1989年，微生物学评论(Microbiol.Rev.)，53:148-170)并且实际上规模较小。这可能涉及原生质体形成、粘性液体处理(即聚乙二醇溶液)、玻璃管的逐个旋动和随后的选择性平板接种。此外，原生质体形成(protoplasting)的条件可能难以确定，并且产量通常可能非常低。此外，原生质体可以含有多个核，使得引入所需的遗传操作可能导致形成异核原生质体，所述异核原生质体可能难以与同核原生质体分离。

此外，典型的丝状真菌细胞(包含源自原生质体的那些)生长为被称为菌丝的长纤维，其可以形成被称为菌丝体的密集菌丝网络。这些菌丝可以含有多个核，这些核在基因型上可以彼此不同。菌丝可以分化并形成无性孢子，其可以很容易地分散在空气中。如果菌丝含有不同基因型的核，则孢子也会含有核的混合物。由于真菌生长的这一方面，遗传操作固有地产生混合群体，其必须被纯化至同质性，以便评估所进行的遗传变化的任何影响。此外，在自动化环境中，孢子会导致设备污染，这可能会对纯化菌株的能力产生负面影响，并可能污染在设备上执行的任何其它工作。

为了减轻孢子的空中分散，可以使丝状真菌在浸没培养物中生长。然而，在浸没培养物中通过菌丝丝状真菌生长形成的菌丝体可能影响培养液的流变学性质。通常，培养液的粘度越高，氧和营养物的分布越不均匀，并且搅拌培养物所需的能量越多。在一些情况下，由菌丝丝状真菌生长引起的培养液粘度变得足够高以显著干扰氧和营养物的溶解，从而不利地影响真菌的生长并最终影响任何所需目标产物的产量和产率。

因此，本领域迫切需要对丝状真菌进行工程化改造的新方法，其不具有传统真菌菌株建立程序所固有的上述缺点，并且极大地加速了发现和合并有益突变的过程。

本公开克服了在自动化高通量平台中遗传操作丝状真菌所固有的许多挑战。本文提供的方法被设计成通过使用自动化共转化或自动化分裂标记设计转化并结合转化体的自动筛选来并入遗传变化，从而允许在不经历有性杂交的情况下在两个菌株之间交换遗传性状以生成真菌生产菌株。本公开还提供了一种生成大量原生质体的程序和一种存储它们以供以后使用的装置。大批容易获得的感受态细胞可以极大地促进自动化。

发明内容