[发明专利]血浆微量样品中肿瘤源性细胞外囊泡的纳米等离激元定量

说明书

本文描述了快速、超灵敏且廉价的纳米等离激元增强散射(nPES)测定，其直接定量了来自少至1μL的血浆的肿瘤源性EV。该测定使用了金纳米球和纳米棒与EV‑特异性以及肿瘤源性EV‑特异性的结合，以产生局部等离激元效应，其增强了肿瘤源性EV的检测灵敏性和特异性。这种nPES方法还是一种评估胰腺癌阶段和治疗响应的非侵入性方法，其可以很容易地改进以用于临床使用，并且很容易适用于对具有疾病特异性EV蛋白质的其他病症进行诊断和监测。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年12月30日提交的美国临时专利申请号62/440,494的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文中。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在国立卫生研究院授予的RO1 AI113725和RO1 AI122932的政府支持下完成的。政府拥有本发明的一定权利。

背景技术

细胞外囊泡(EV)，包括外泌体和其他膜囊泡，由大部分细胞大量分泌到细胞外空间，它们最终可以从细胞外空间在循环中积聚。EV活跃地参与肿瘤起始、进展和转移，反映其亲代细胞和组织起源的穿梭信号分子(蛋白质和核酸)。

因此，循环肿瘤源性EV具有以非侵入性方式检测癌症的巨大潜力，然而，由于缺乏1)用于进行EV分析的简单的方法和2)区分肿瘤源性EV与正常EV的分子靶标，将肿瘤EV转化为癌症检测测定一直具有挑战性。常规检测技术需要耗时且劳动密集的分离和纯化程序(例如，超速离心、免疫磁性富集、多级过滤或基于微流控的分离)，然后进行EV定量和/或携带分子内容物(例如，mRNA、miRNA和蛋白质)的EV的分析。这些技术对于临床和研究用途是不实际的，因为它们需要相对大的样品体积并且复杂、低通量、昂贵以及具有较长的周转时间。样品要求对于基于动物的研究是一种特别的障碍，因为可以从人类疾病的常见小鼠模型获得的血液体积非常有限并且排除了纵向研究。用于标准EV分析的富集EV的膜蛋白(例如，CD9、CD63和CD81)存在于源自大多数细胞类型的EV，但是目前很少有人提出EV蛋白质与不同类型的癌症相关。

发明内容

本技术的实施方式公开了用于检测癌症特异性蛋白质的方法。该方法包括使含有EV的样品与缀合有针对EV分子的第一抗体的表面接触，以将所述EV与含有EV的样品分离；从表面上除去含有EV的样品；将该表面与缀合有针对癌症特异性蛋白质的第二抗体的第一组纳米颗粒一起孵育；以及，通过检测第二抗体与EV之间的结合来检测所述癌症特异性蛋白质是否存在于该含有EV的样品中。接触步骤还包括将表面与针对EV分子的第一抗体缀合。在某些实施方式中，EV蛋白质选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、肿瘤易感基因101(TSG101)、热休克70kDa蛋白4(HSP70)、Rab-5b、程序性细胞死亡6-互动蛋白(AIP1/Alix)、水通道蛋白2(AQP2)、血管内皮生长因子受体1(FLT1)、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸以及鞘磷脂。

孵育步骤还包括将表面与缀合有针对EV分子的第三抗体的第二组纳米颗粒一起孵育，其中，EV蛋白质选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD24、CD26、CD10、TSG101、HSP70、Rab-5b、AIP1/Alix、AQP2、FLT1、含有岩藻糖残基的N-聚糖、磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂；以及，纳米颗粒包括多个纳米球、多个纳米棒或其组合。检测步骤还包括检测针对癌症特异性蛋白质的第二抗体与EV之间的结合；以及检测针对EV分子的第三抗体与EV之间的结合。此外，检测步骤还包括形成EV复合物，该EV复合物包括EV、经由第二抗体结合至EV的第一纳米颗粒以及经由第三抗体结合至EV的第二纳米颗粒，其中，第一纳米颗粒可以与第二纳米颗粒相互作用，以在第一纳米颗粒与第二纳米颗粒之间达到一定距离时产生纳米等离激元；以及检测所述纳米等离激元。