[发明专利]基于基因组编辑的外显子跳跃诱导方法

权利要求书

1.一种使用CRISPR-Cas和向导RNA的、用于跳过基因组上的靶基因的靶外显子的方法，其特征在于，所述向导RNA具有使CRISPR-Cas切断位点配置在距离靶外显子的紧前方的剪接供体位点或靶外显子的紧后方的剪接受体位点80个碱基以内的位置的间隔序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，使用两种以上所述向导RNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，CRISPR-Cas为RuvC结构域的核酸酶活性残基被置换的切口酶修饰型Cas，使用针对靶基因的有义链的向导RNA和针对反义链的向导RNA，两向导RNA具有使靶基因的有义链中的切断位点和靶基因的反义链中的切断位点均配置在距离靶外显子的紧前方的剪接供体位点或靶外显子的紧后方的剪接受体位点80个碱基以内的位置的间隔序列。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，CRISPR-Cas为Cas9。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，Cas9为酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)来源或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)来源。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，CRISPR-Cas为Cpf1。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，Cpf1为氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)BV3L6来源或毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)来源。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，靶基因为人抗肌萎缩蛋白基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，靶外显子为外显子45。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述向导RNA具有由序列号17～42中的任一碱基序列的碱基编号17～36的碱基序列、序列号44～45中的任一碱基序列的碱基编号17～39的碱基序列、或序列号50～53中的任一碱基序列的碱基编号24～43的碱基序列构成的间隔序列。

11.一种试剂，其特征在于，其为包含CRISPR-Cas和向导RNA的、用于跳过基因组上的靶基因的靶外显子的试剂，所述向导RNA具有使CRISPR-Cas切断位点配置在距离靶外显子的紧前方的剪接供体位点或靶外显子的紧后方的剪接受体位点80个碱基以内的位置的间隔序列。

12.一种用于评价外显子跳跃的方法，其特征在于，使用在编码区域内插入了包含第1内含子、分析对象外显子和第2内含子的序列的标志基因，设计成分析对象外显子被跳过时标志基因发挥功能。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，外显子跳跃为使用CRISPR-Cas和向导RNA的外显子跳跃。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，使用转座子载体将标志基因插入分析对象细胞的基因组。

15.根据权利要求12～14中任一项所述的方法，其中，标志基因为荧光素酶基因。

16.根据权利要求12～15中任一项所述的方法，其中，分析对象外显子为人抗肌萎缩蛋白基因的外显子45。